【關(guān)鍵詞】 DNA

摘要：目的運用ICM（Image Cytometer）對圖像進行處理和分析，在給出細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)的同時對DNA的含量進行定量分析，能有效地協(xié)助醫(yī)生對諸如腫瘤等多種病癥做出診斷。方法以武漢大學(xué)光譜與成像儀器工程技術(shù)研究中心研制的“全自動DNA細(xì)胞圖像定量分析儀”（DNAICM）為平臺，對雞血紅細(xì)胞和宮頸脫落細(xì)胞進行液基薄層制片，用Feulgen染色法染色，對DNAICM上獲取的細(xì)胞染色圖像進行扣背底算法處理。結(jié)果 用冷酸解法對兩種細(xì)胞進行Feulgen染色后細(xì)胞著色較深且均勻；進行扣背底算法處理后的細(xì)胞圖像的灰度值方差為0.524，比不進行處理時（0.919）要小。 結(jié)論冷酸解法更適用于雞血紅細(xì)胞和宮頸脫落細(xì)胞的Feulgen染色；扣背底算法可以有效地減少視場不勻帶來的誤差。

關(guān)鍵詞：DNAICM； DNA定量分析； 扣背底； 積分光密度； DI直方圖； Feulgen染色

Research of DNA Quantitative Cytology Based on Image Processing

Abstract：ObjectiveImage processing and analyzing by use of ICM（Image Cytometer）can be conductive to doctors in tumor diagnoses. MethodsMonolayer of chicken red blood cells and cast-off cervical cells were deposited onto microscopic slides by liquid based sampling preparation. The slides were stained by Feulgen coloration for determination of amount of DNA using an automated DNA imaging cytometer (made by Engineering Research Center of Spectrum & Imaging Instrument， Wuhan University) and cell images obtained were processed by the method of distracting background in image processing.ResultsThe color of two types of cells after cold acidolysis used in Feulgen coloration was deeper and more symmetrical than that after hot acidolysis. The gray scale variance of cell images after disposure of distracting background was smaller than that of no such disposure. ConclusionCold acidolysis was more suitable in Feulgen coloration of chicken red blood cells and castoff cervical cells. Method of distracting background could effectively diminish the asymmetry of the background of cell images.

Key words：DNAICM ; DNA quantitative cytology ; Distracting background; Integral optical density; DI table; Feulgen coloration 20世紀(jì)90年代初至今，計算機成本的下降以及性能的大幅度改進、CCD技術(shù)和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，使得ICM技術(shù)在癌癥早期診斷的細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)中異軍突起。其原理是醫(yī)學(xué)病理上常用的細(xì)胞切片、印片或涂片，經(jīng)固定液固定后用Feulgen染色，利用精密透射光學(xué)顯微鏡、窄帶干涉濾光片、高精度圖像采集系統(tǒng)將細(xì)胞DNA的數(shù)字化灰度圖像攝入計算機，通過圖像處理技術(shù)對該細(xì)胞DNA圖像灰度形態(tài)進行定量分析，計算出每個細(xì)胞的積分光密度（IOD）值，再根據(jù)BeerLambert光吸收定律將單個細(xì)胞的IOD值與標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)細(xì)胞相比后，換算成細(xì)胞DNA的絕對質(zhì)量并給出被測細(xì)胞的倍體分布及細(xì)胞周期（即G0/G1期，S期，G2/M期）等參數(shù)。醫(yī)師借助這些參數(shù)即可作出診斷。此方法簡便、實用而且準(zhǔn)確度高，對人體及其它動物腫瘤或癌癥的早期病理分析和診斷研究具有重大參考意義。ICM(Image Cytometer)不僅能對極少量的細(xì)胞核作DNA含量和倍體分析，而且可同時測量細(xì)胞核的形態(tài)參數(shù)（面積、形態(tài)因子、紋理特征等）并通過圖像處理技術(shù)加以輔助分析。因此ICM及其儀器在國際上逐步在病理診斷學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織胚胎學(xué)、遺傳免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用，已經(jīng)成為DNA定量測量，尤其是腫瘤的細(xì)胞學(xué)診斷的一項快速、客觀、有效的重要手段［1，2］ 。近幾年來，用DNA倍體分析系統(tǒng)進行宮頸癌及癌前病變的診斷在國外已有大量報道［3～10］ 。此外，細(xì)胞DNA定量分析診斷方法在北美及歐洲已作為一種常規(guī)臨床檢測方法之一 ［11～13］。

1 材料與方法

1.1 材料宮頸脫落細(xì)胞樣本取自湖北省武漢市腫瘤醫(yī)院、湖北省黃石市第一醫(yī)院和山東淄博計劃生育研究所，保存于50%的乙醇溶液（細(xì)胞保存液）中。雞血紅細(xì)胞取自健康公雞的動脈血，加入0.3%～0.4%的檸檬酸鈉抗凝劑，保存于50%的乙醇溶液（細(xì)胞保存液）中。

1.2 方法采用液基薄層制片技術(shù)，對制作的玻片進行Feulgen染色，再利用全自動DNA細(xì)胞圖像定量分析儀完成對細(xì)胞圖像的采集、處理和DNA定量分析。

1.2.1 液基薄層制片 在細(xì)胞保存液中加入0.1%DTT消化液放在振蕩器上振蕩2 h，然后將消化后的細(xì)胞懸液離心5 min(800 r/min)，棄上清液后加入50%乙醇分別清洗、離心2次(800 r/min×5 min/次)。然后將用保存液稀釋的細(xì)胞混懸液放入細(xì)胞涂片離心機甩片5 min，制成薄層細(xì)胞學(xué)玻片［14］ 。

1.2.2 Feulgen染色 固定液：10%緩沖福爾馬林液（pH 7 .4）；酸解液：鹽酸，濃度5mol/L；酸解溫度：25℃(與武漢四五月份室內(nèi)溫度基本接近)；酸解時間： 45 min；測量濾色鏡波長：560 nm。染色過程： 涂片空氣干燥1 h，固定液固定1 h；蒸餾水漂洗10 min；5 mol/L HCl，25℃酸解45 min，(溫控水浴)；蒸餾水漂洗5 min；與Schiff染液反應(yīng)45 min (25℃)；蒸餾水漂洗5 min；自來水沖洗15 min (穩(wěn)水)，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封固［15，16］ 。

1.2.3 DNA定量分析 全自動DNA細(xì)胞圖像定量分析儀的系統(tǒng)構(gòu)成及分析流程 ：武漢大學(xué)光譜與成像儀器工程技術(shù)研究中心自主開發(fā)的全自動DNA細(xì)胞圖像定量分析儀硬件系統(tǒng)由Olympus BX41顯微鏡、恒流源、自動上下片系統(tǒng)、精確位移三維平臺(包括載物臺、步進電機、三軸原點定位傳感器、條碼掃描器等)、CCD攝像機、操縱桿、控制器和、計算機等組成（見圖1）。軟件系統(tǒng)自動聚焦、掃描、圖像采集程序(盧國強. ICM分析自動化及應(yīng)用研究.武漢大學(xué)碩士學(xué)位論文)，細(xì)胞圖像數(shù)據(jù)庫、細(xì)胞特征庫、知識模型庫和智能分析處理程序(張燕. 遺傳算法和支持向量機在DNA細(xì)胞圖像分析儀中的應(yīng)用.武漢大學(xué)碩士學(xué)位論文)，六大功能模塊構(gòu)成。分析流程如圖2所示。

圖1 全自動DNA細(xì)胞圖像定量分析儀硬件構(gòu)成 （略）

圖2 DNA定量分析的流程（略）

扣背底算法 ：為了克服光學(xué)傳遞中的不均勻性，我們采集了一幅空視野作為亮場背底圖像，然后在后面采集的細(xì)胞圖像中除去這個背底圖像，用這種方法可以有效地減少視場不勻帶來的誤差。全局扣背底為測量細(xì)胞圖像分析儀的光均勻度，在玻片上尋找一個空白位置（染色后的背底，一般還會有少量的雜質(zhì)）采集一幅背底圖像，背底圖像的灰度分布不均勻（見圖3），其灰度直方圖也不是規(guī)則的單峰，這是與顯微鏡的光路系統(tǒng)直接相關(guān)的，如果不采用軟件系統(tǒng)進行校正，會帶來極大的測量誤差。均勻度指背景光強的灰度標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（coefficient of variation）。它們描述了背景光的均勻性，要求背景圖像的像素點灰度變異系數(shù)小于3%。其公式如下：sd=1 MN∑M i=1∑N j=1fij(x，y)-― f(x，y)21/2 （1）CV=sd ― f(x，y)

其中sd為圖像各個像素灰度的標(biāo)準(zhǔn)差，fij(χ，y) 為某一個像素點的灰度值（0～255），― f(x，y)為圖像所有像素灰度的平均值， M，N分別是圖像的長和寬。 cv為圖像各個像素灰度的變異系數(shù)。

圖3 采集的背底圖像 （略）

圖4 背底圖像分割效果圖 （略）

圖5 變異系數(shù)（略）

由圖4可見，由于背底圖像的灰度分布不均勻，二值化后的圖像存在不規(guī)則邊緣（圖中藍(lán)色表示背景中灰度值較小的區(qū)域）。圖5中，其直方圖的第1個峰為某處視場進行扣背底后計算的像素點灰度值變異系數(shù)（1.08%），第2個峰為未扣背底計算的變異系數(shù)（3.82%），第3個峰為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的變異系數(shù)最大值（3%）。扣除局部背底的方法與全局扣背底類似。一般是將細(xì)胞的外接矩形擴展2個像素，然后在此范圍內(nèi)計算除了細(xì)胞的有效像素之外的所有背景像素的灰度平均值，并以此平均值作為平均背底在細(xì)胞的每個有效像素中扣除。扣除算法可以用相除或相減（本DNAICM程序中用相除）。由于雞血紅細(xì)胞比宮頸脫落細(xì)胞小得多，且有的細(xì)胞連接較緊密，采用將細(xì)胞的外接矩形擴展2個像素的方法會使外擴區(qū)域中包含其他雞血紅細(xì)胞的有效像素，從而在計算積分光密度時產(chǎn)生誤差，所以采用外擴1個像素的方法。

2 結(jié)果

2.1 冷酸法Feulgen染色后的效果20倍鏡下經(jīng)45 min酸解的雞血紅細(xì)胞在全自動DNA細(xì)胞圖像定量分析儀中采集的圖像如圖6～8所示。由圖可見，細(xì)胞邊緣清晰，著色均勻，效果優(yōu)于熱酸法。

圖6 原始細(xì)胞圖像（略）

圖7 背底圖像（cv=1.62%）（略）

圖8 全局扣背底后的圖像（略）

2.2 20倍鏡下雞血紅細(xì)胞積分光密度直方圖的比較20倍鏡下經(jīng)45 min酸解的雞血紅細(xì)胞（十個視場，共1500個細(xì)胞）分別按照下面四種不同的方法進行實驗，并比較實驗結(jié)果（見圖9）。結(jié)果見表1。由表1可以得出：IOD離散程度全局扣背底加局部扣背底時最小。理想的玻片背底是均勻的，但實際上由于經(jīng)Feulgen染色后玻片上殘留染色物質(zhì)的分布不均和照明光源的不均勻性，使得玻片背底實際的灰度分布不均勻。如果不扣除這種不均勻性，在玻片不同位置或者是視場的不同位置測得的相同細(xì)胞核的灰度值不同，計算出的IOD值也會受影響。而全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。再進行一次局部扣被底，把背景不均勻性的影響再次減小，所以此時得到的IOD的主峰緊密程度最好，離散程度最小；IOD方差各不相同，其中全局扣背底比不全局扣背底所得的方差要小。這也是由于全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。

表1 4種扣背底方法的比較（略）

圖9 （略）

（1）全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖；

（2）全局不扣背底、局部扣背底后細(xì)胞IOD直方圖；

（3）全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖；

（4）全局不扣底、局部不扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖。

坐標(biāo)系中橫坐標(biāo)表示IOD值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞個數(shù)

2.3 宮頸脫落細(xì)胞DI（DNA Index，DNA指數(shù)）直方圖、散點圖 20倍鏡下的正常人體宮頸細(xì)胞和發(fā)生癌變的人體宮頸細(xì)胞（全局扣背底、局部扣背底）DI直方圖、散點圖的比較（見圖10）。

圖10 （略）

（1）、（2）正常人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點圖；（3）、（4）發(fā)生癌變的人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點圖

直方圖中橫坐標(biāo)表示DI值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞個數(shù)；散點圖中橫坐標(biāo)表示DI值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞核面積

由于宮頸脫落細(xì)胞比雞血紅細(xì)胞大得多且DNA含量較穩(wěn)定，所以正常人體細(xì)胞IOD直方圖中IOD值的離散程度更小（約90%的細(xì)胞在主峰的正負(fù)10%范圍內(nèi)），DI值的主峰更細(xì)，系統(tǒng)測量的結(jié)果更精確。由于發(fā)生癌變的細(xì)胞中DNA含量增加，DI值大于2的細(xì)胞個數(shù)明顯增多，醫(yī)生可以根據(jù)DI值來判斷細(xì)胞的癌變程度并作出診斷。

3 結(jié)論

細(xì)胞DNA定量分析對從硬件平臺到軟件算法都有著極為嚴(yán)格的要求，以保證定量分析的精度和診斷結(jié)果精確性。DNA定量分析的關(guān)鍵是對細(xì)胞的積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)（面積、形狀因子等）的準(zhǔn)確測量。其中第一步就是要獲取準(zhǔn)確、清晰的圖像，這就對細(xì)胞制片和染色環(huán)節(jié)提出了嚴(yán)格的要求。液基薄層制片技術(shù)的運用，F(xiàn)eulgen染色中冷酸法的選擇保證了所制玻片完全滿足DNA定量分析的需要。在細(xì)胞積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)測量之前對細(xì)胞圖像進行扣背底處理，很好的消除了顯微鏡光路系統(tǒng)帶來的測量誤差，克服了光學(xué)傳遞中的不均勻性，使得細(xì)胞積分光密度的測定更加精確。

［1］ 徐元. ICM技術(shù)研究進展及其應(yīng)用前景［J］.實用腫瘤雜志，1999 ，14（1）：3.

［2］ 張亞偉，沈鎮(zhèn)廟. 圖象分析法檢測乳腺癌細(xì)胞DNA含量及其意義［J］.外科雜志，1997，2（1）：16.

［3］ Bcking A， Adler CP， Common HH， et al. Algorithm for DNA cytophotometric diagnosis and grading of malignancy［J］.Anal Quant Cytol，1984，6(1):1.

［4］ B?king A， Hilgarth M， Auffermann W， et al. DNA-cytometric diagnosis of prospective malignancy in borderline lesions of the uterine cervix ［J］.Acta Cytol，1986，30(6):608.

［5］ Grote HJ， Friedrichs N， Pomjanski N， et al.Prognostic significance of DNA cytometry in carcinoma of the uterine cervix FIGO Stage IB and II［J］. Anal Cell Pathol，2001，23(3):97.

［6］ Fu YW， Reagen JW， Fu AS， et al. Adenocarcinoma and mixed carcinoma of the uterine cervix. 2. Prognostic value of nuclear DNA analylsis［J］. Cancer. 1982，49:2572.

［7］ Chatelain R， Schunck T， Schindler EM， et al. Diagnosis of prospective malignacy in koilocytic dysplasia of the cervix with DNAcytometry［J］. J Reprod Med. 1989，34:505.

［8］ Kashyap V， Das DK， Luthra UK. Microphotometric nuclear DNA analysis in cervical dysplasi of the uterine cervix:its relation to the progression to malignancy and regression to normal［J］. Neoplasma.1990，37：487.

［9］ Bollmann R， bocking A. Prognostic validity of DNA-imaging-cytometry in cervical dysplasias［J］. Verh Dtsch Ges Path. 1996，80：557.

［10］ Hering B， Horn LC， Nenning H， et al. Predictive value of DNA cytometry in CIN 1 and 2. Image analysis of 193 cases［J］. Anal Quant Cytol Histol. 2000，22：333.

［11］ Torsten W. Remmerbach， Horst Weidenbach， Natalja Pomjanski， Kristinae Knops， Stefanie Mathes， Alexander Hemprichc and Alfred B?cking. Cytologic and DNA-cytometric early diagnosis of oral cancer［J］. Analytical Cellular Pathology 2001，22： 211.

［12］ Azua J. Romeo P. Morales M et al. DNA quantification as a prognostic factor in gastric adenocarcinoma［J］. Anal Quant Cytol Histol 1998，20：221.

［13］ Dey P. Luthra UK. Prasad A et al. Cytologic grading and DNA image cytometry of breast carcinoma on fine needle aspiration cytology smears［J］. Anal Quant Cytol Histol 1999，21:17.

［14］ 孫小蓉，李玉蘭，車東媛，等. 用細(xì)胞DNA 定量分析方法進行宮頸癌普查的臨床研究［J］.診斷病理學(xué)雜志，2005， 12（1）：13.

［15］ ESACP DNA Consensus in image cytometry， http://www. cyto.purdue.edu/mirrors/valet/ esacimag.htm.

［16］ 吳 波. Feulgen的染色標(biāo)準(zhǔn)化［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2001，17(1)：71.