【關(guān)鍵詞】 DNA

摘要：目的運(yùn)用ICM（Image Cytometer）對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析，在給出細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)的同時(shí)對(duì)DNA的含量進(jìn)行定量分析，能有效地協(xié)助醫(yī)生對(duì)諸如腫瘤等多種病癥做出診斷。方法以武漢大學(xué)光譜與成像儀器工程技術(shù)研究中心研制的“全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀”（DNAICM）為平臺(tái)，對(duì)雞血紅細(xì)胞和宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行液基薄層制片，用Feulgen染色法染色，對(duì)DNAICM上獲取的細(xì)胞染色圖像進(jìn)行扣背底算法處理。結(jié)果 用冷酸解法對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行Feulgen染色后細(xì)胞著色較深且均勻；進(jìn)行扣背底算法處理后的細(xì)胞圖像的灰度值方差為0.524，比不進(jìn)行處理時(shí)（0.919）要小。 結(jié)論冷酸解法更適用于雞血紅細(xì)胞和宮頸脫落細(xì)胞的Feulgen染色；扣背底算法可以有效地減少視場(chǎng)不勻帶來(lái)的誤差。

關(guān)鍵詞：DNAICM； DNA定量分析； 扣背底； 積分光密度； DI直方圖； Feulgen染色

Research of DNA Quantitative Cytology Based on Image Processing

Abstract：ObjectiveImage processing and analyzing by use of ICM（Image Cytometer）can be conductive to doctors in tumor diagnoses. MethodsMonolayer of chicken red blood cells and cast-off cervical cells were deposited onto microscopic slides by liquid based sampling preparation. The slides were stained by Feulgen coloration for determination of amount of DNA using an automated DNA imaging cytometer (made by Engineering Research Center of Spectrum & Imaging Instrument， Wuhan University) and cell images obtained were processed by the method of distracting background in image processing.ResultsThe color of two types of cells after cold acidolysis used in Feulgen coloration was deeper and more symmetrical than that after hot acidolysis. The gray scale variance of cell images after disposure of distracting background was smaller than that of no such disposure. ConclusionCold acidolysis was more suitable in Feulgen coloration of chicken red blood cells and castoff cervical cells. Method of distracting background could effectively diminish the asymmetry of the background of cell images.

Key words：DNAICM ; DNA quantitative cytology ; Distracting background; Integral optical density; DI table; Feulgen coloration 20世紀(jì)90年代初至今，計(jì)算機(jī)成本的下降以及性能的大幅度改進(jìn)、CCD技術(shù)和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，使得ICM技術(shù)在癌癥早期診斷的細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)中異軍突起。其原理是醫(yī)學(xué)病理上常用的細(xì)胞切片、印片或涂片，經(jīng)固定液固定后用Feulgen染色，利用精密透射光學(xué)顯微鏡、窄帶干涉濾光片、高精度圖像采集系統(tǒng)將細(xì)胞DNA的數(shù)字化灰度圖像攝入計(jì)算機(jī)，通過(guò)圖像處理技術(shù)對(duì)該細(xì)胞DNA圖像灰度形態(tài)進(jìn)行定量分析，計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞的積分光密度（IOD）值，再根據(jù)BeerLambert光吸收定律將單個(gè)細(xì)胞的IOD值與標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)細(xì)胞相比后，換算成細(xì)胞DNA的絕對(duì)質(zhì)量并給出被測(cè)細(xì)胞的倍體分布及細(xì)胞周期（即G0/G1期，S期，G2/M期）等參數(shù)。醫(yī)師借助這些參數(shù)即可作出診斷。此方法簡(jiǎn)便、實(shí)用而且準(zhǔn)確度高，對(duì)人體及其它動(dòng)物腫瘤或癌癥的早期病理分析和診斷研究具有重大參考意義。ICM(Image Cytometer)不僅能對(duì)極少量的細(xì)胞核作DNA含量和倍體分析，而且可同時(shí)測(cè)量細(xì)胞核的形態(tài)參數(shù)（面積、形態(tài)因子、紋理特征等）并通過(guò)圖像處理技術(shù)加以輔助分析。因此ICM及其儀器在國(guó)際上逐步在病理診斷學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織胚胎學(xué)、遺傳免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，已經(jīng)成為DNA定量測(cè)量，尤其是腫瘤的細(xì)胞學(xué)診斷的一項(xiàng)快速、客觀、有效的重要手段［1，2］ 。近幾年來(lái)，用DNA倍體分析系統(tǒng)進(jìn)行宮頸癌及癌前病變的診斷在國(guó)外已有大量報(bào)道［3～10］ 。此外，細(xì)胞DNA定量分析診斷方法在北美及歐洲已作為一種常規(guī)臨床檢測(cè)方法之一 ［11～13］。

1 材料與方法

1.1 材料宮頸脫落細(xì)胞樣本取自湖北省武漢市腫瘤醫(yī)院、湖北省黃石市第一醫(yī)院和山東淄博計(jì)劃生育研究所，保存于50%的乙醇溶液（細(xì)胞保存液）中。雞血紅細(xì)胞取自健康公雞的動(dòng)脈血，加入0.3%～0.4%的檸檬酸鈉抗凝劑，保存于50%的乙醇溶液（細(xì)胞保存液）中。

1.2 方法采用液基薄層制片技術(shù)，對(duì)制作的玻片進(jìn)行Feulgen染色，再利用全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀完成對(duì)細(xì)胞圖像的采集、處理和DNA定量分析。

1.2.1 液基薄層制片 在細(xì)胞保存液中加入0.1%DTT消化液放在振蕩器上振蕩2 h，然后將消化后的細(xì)胞懸液離心5 min(800 r/min)，棄上清液后加入50%乙醇分別清洗、離心2次(800 r/min×5 min/次)。然后將用保存液稀釋的細(xì)胞混懸液放入細(xì)胞涂片離心機(jī)甩片5 min，制成薄層細(xì)胞學(xué)玻片［14］ 。

1.2.2 Feulgen染色 固定液：10%緩沖福爾馬林液（pH 7 .4）；酸解液：鹽酸，濃度5mol/L；酸解溫度：25℃(與武漢四五月份室內(nèi)溫度基本接近)；酸解時(shí)間： 45 min；測(cè)量濾色鏡波長(zhǎng)：560 nm。染色過(guò)程： 涂片空氣干燥1 h，固定液固定1 h；蒸餾水漂洗10 min；5 mol/L HCl，25℃酸解45 min，(溫控水浴)；蒸餾水漂洗5 min；與Schiff染液反應(yīng)45 min (25℃)；蒸餾水漂洗5 min；自來(lái)水沖洗15 min (穩(wěn)水)，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封固［15，16］ 。

1.2.3 DNA定量分析 全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀的系統(tǒng)構(gòu)成及分析流程 ：武漢大學(xué)光譜與成像儀器工程技術(shù)研究中心自主開發(fā)的全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀硬件系統(tǒng)由Olympus BX41顯微鏡、恒流源、自動(dòng)上下片系統(tǒng)、精確位移三維平臺(tái)(包括載物臺(tái)、步進(jìn)電機(jī)、三軸原點(diǎn)定位傳感器、條碼掃描器等)、CCD攝像機(jī)、操縱桿、控制器和、計(jì)算機(jī)等組成（見圖1）。軟件系統(tǒng)自動(dòng)聚焦、掃描、圖像采集程序(盧國(guó)強(qiáng). ICM分析自動(dòng)化及應(yīng)用研究.武漢大學(xué)碩士學(xué)位論文)，細(xì)胞圖像數(shù)據(jù)庫(kù)、細(xì)胞特征庫(kù)、知識(shí)模型庫(kù)和智能分析處理程序(張燕. 遺傳算法和支持向量機(jī)在DNA細(xì)胞圖像分析儀中的應(yīng)用.武漢大學(xué)碩士學(xué)位論文)，六大功能模塊構(gòu)成。分析流程如圖2所示。

圖1 全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀硬件構(gòu)成 （略）

圖2 DNA定量分析的流程（略）

扣背底算法 ：為了克服光學(xué)傳遞中的不均勻性，我們采集了一幅空視野作為亮場(chǎng)背底圖像，然后在后面采集的細(xì)胞圖像中除去這個(gè)背底圖像，用這種方法可以有效地減少視場(chǎng)不勻帶來(lái)的誤差。全局扣背底為測(cè)量細(xì)胞圖像分析儀的光均勻度，在玻片上尋找一個(gè)空白位置（染色后的背底，一般還會(huì)有少量的雜質(zhì)）采集一幅背底圖像，背底圖像的灰度分布不均勻（見圖3），其灰度直方圖也不是規(guī)則的單峰，這是與顯微鏡的光路系統(tǒng)直接相關(guān)的，如果不采用軟件系統(tǒng)進(jìn)行校正，會(huì)帶來(lái)極大的測(cè)量誤差。均勻度指背景光強(qiáng)的灰度標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（coefficient of variation）。它們描述了背景光的均勻性，要求背景圖像的像素點(diǎn)灰度變異系數(shù)小于3%。其公式如下：sd=1 MN∑M i=1∑N j=1fij(x，y)-― f(x，y)21/2 （1）CV=sd ― f(x，y)

其中sd為圖像各個(gè)像素灰度的標(biāo)準(zhǔn)差，fij(χ，y) 為某一個(gè)像素點(diǎn)的灰度值（0～255），― f(x，y)為圖像所有像素灰度的平均值， M，N分別是圖像的長(zhǎng)和寬。 cv為圖像各個(gè)像素灰度的變異系數(shù)。

圖3 采集的背底圖像 （略）

圖4 背底圖像分割效果圖 （略）

圖5 變異系數(shù)（略）

由圖4可見，由于背底圖像的灰度分布不均勻，二值化后的圖像存在不規(guī)則邊緣（圖中藍(lán)色表示背景中灰度值較小的區(qū)域）。圖5中，其直方圖的第1個(gè)峰為某處視場(chǎng)進(jìn)行扣背底后計(jì)算的像素點(diǎn)灰度值變異系數(shù)（1.08%），第2個(gè)峰為未扣背底計(jì)算的變異系數(shù)（3.82%），第3個(gè)峰為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的變異系數(shù)最大值（3%）。扣除局部背底的方法與全局扣背底類似。一般是將細(xì)胞的外接矩形擴(kuò)展2個(gè)像素，然后在此范圍內(nèi)計(jì)算除了細(xì)胞的有效像素之外的所有背景像素的灰度平均值，并以此平均值作為平均背底在細(xì)胞的每個(gè)有效像素中扣除。扣除算法可以用相除或相減（本DNAICM程序中用相除）。由于雞血紅細(xì)胞比宮頸脫落細(xì)胞小得多，且有的細(xì)胞連接較緊密，采用將細(xì)胞的外接矩形擴(kuò)展2個(gè)像素的方法會(huì)使外擴(kuò)區(qū)域中包含其他雞血紅細(xì)胞的有效像素，從而在計(jì)算積分光密度時(shí)產(chǎn)生誤差，所以采用外擴(kuò)1個(gè)像素的方法。

2 結(jié)果

2.1 冷酸法Feulgen染色后的效果20倍鏡下經(jīng)45 min酸解的雞血紅細(xì)胞在全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀中采集的圖像如圖6～8所示。由圖可見，細(xì)胞邊緣清晰，著色均勻，效果優(yōu)于熱酸法。

圖6 原始細(xì)胞圖像（略）

圖7 背底圖像（cv=1.62%）（略）

圖8 全局扣背底后的圖像（略）

2.2 20倍鏡下雞血紅細(xì)胞積分光密度直方圖的比較20倍鏡下經(jīng)45 min酸解的雞血紅細(xì)胞（十個(gè)視場(chǎng)，共1500個(gè)細(xì)胞）分別按照下面四種不同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖9）。結(jié)果見表1。由表1可以得出：IOD離散程度全局扣背底加局部扣背底時(shí)最小。理想的玻片背底是均勻的，但實(shí)際上由于經(jīng)Feulgen染色后玻片上殘留染色物質(zhì)的分布不均和照明光源的不均勻性，使得玻片背底實(shí)際的灰度分布不均勻。如果不扣除這種不均勻性，在玻片不同位置或者是視場(chǎng)的不同位置測(cè)得的相同細(xì)胞核的灰度值不同，計(jì)算出的IOD值也會(huì)受影響。而全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。再進(jìn)行一次局部扣被底，把背景不均勻性的影響再次減小，所以此時(shí)得到的IOD的主峰緊密程度最好，離散程度最小；IOD方差各不相同，其中全局扣背底比不全局扣背底所得的方差要小。這也是由于全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。

表1 4種扣背底方法的比較（略）

圖9 （略）

（1）全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖；

（2）全局不扣背底、局部扣背底后細(xì)胞IOD直方圖；

（3）全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖；

（4）全局不扣底、局部不扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖。

坐標(biāo)系中橫坐標(biāo)表示IOD值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞個(gè)數(shù)

2.3 宮頸脫落細(xì)胞DI（DNA Index，DNA指數(shù)）直方圖、散點(diǎn)圖 20倍鏡下的正常人體宮頸細(xì)胞和發(fā)生癌變的人體宮頸細(xì)胞（全局扣背底、局部扣背底）DI直方圖、散點(diǎn)圖的比較（見圖10）。

圖10 （略）

（1）、（2）正常人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點(diǎn)圖；（3）、（4）發(fā)生癌變的人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點(diǎn)圖

直方圖中橫坐標(biāo)表示DI值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞個(gè)數(shù)；散點(diǎn)圖中橫坐標(biāo)表示DI值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞核面積

由于宮頸脫落細(xì)胞比雞血紅細(xì)胞大得多且DNA含量較穩(wěn)定，所以正常人體細(xì)胞IOD直方圖中IOD值的離散程度更小（約90%的細(xì)胞在主峰的正負(fù)10%范圍內(nèi)），DI值的主峰更細(xì)，系統(tǒng)測(cè)量的結(jié)果更精確。由于發(fā)生癌變的細(xì)胞中DNA含量增加，DI值大于2的細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增多，醫(yī)生可以根據(jù)DI值來(lái)判斷細(xì)胞的癌變程度并作出診斷。

3 結(jié)論

細(xì)胞DNA定量分析對(duì)從硬件平臺(tái)到軟件算法都有著極為嚴(yán)格的要求，以保證定量分析的精度和診斷結(jié)果精確性。DNA定量分析的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞的積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)（面積、形狀因子等）的準(zhǔn)確測(cè)量。其中第一步就是要獲取準(zhǔn)確、清晰的圖像，這就對(duì)細(xì)胞制片和染色環(huán)節(jié)提出了嚴(yán)格的要求。液基薄層制片技術(shù)的運(yùn)用，F(xiàn)eulgen染色中冷酸法的選擇保證了所制玻片完全滿足DNA定量分析的需要。在細(xì)胞積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)量之前對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行扣背底處理，很好的消除了顯微鏡光路系統(tǒng)帶來(lái)的測(cè)量誤差，克服了光學(xué)傳遞中的不均勻性，使得細(xì)胞積分光密度的測(cè)定更加精確。

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