作者：李楠，王景美，吳平平，徐佳佳，丁潔，方媛，黃培林

【摘要】 目的： 通過分析p53、Ki67在癌組織和癌周不同距離（距離腫瘤1、2、3 cm）組織中的差異表達，探討大腸癌手術(shù)切緣的分子邊界。方法： 應用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學方法研究44例大腸癌組織和癌周不同距離組織中p53、Ki67的表達情況。結(jié)果： p53、Ki67在大腸癌組織和癌周不同距離（距離腫瘤1、2、3 cm）組織中的表達呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢，其遞減表達差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論： p53、Ki67所表現(xiàn)出的趨勢性差異表達提示，在大腸癌手術(shù)切緣組織中存在分子邊界。應用組織芯片大規(guī)模檢測臨床組織樣本，具有快速、方便、經(jīng)濟、準確的特點。

【關(guān)鍵詞】 大腸癌；組織芯片；分子邊界；p53；Ki67；手術(shù)切緣

大腸癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，由于其起病隱匿，早期常無明顯的臨床表現(xiàn)，故極易延誤診斷和治療，嚴重地威脅著人類健康。目前，手術(shù)切除是治療大腸癌的最主要手段之一，而術(shù)后局部復發(fā)是手術(shù)治療失敗和影響患者預后的重要原因，因此手術(shù)成功與否成為影響大腸癌預后的主要因素。傳統(tǒng)方法判斷手術(shù)切除是否干凈主要基于對切緣組織的常規(guī)病理學（即細胞形態(tài)學）觀察，然而最近研究表明，腫瘤在細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前［1］，其分子水平及生化代謝水平方面已發(fā)生異常改變，出現(xiàn)功能異常的癌基因產(chǎn)物或產(chǎn)物表達增強，即在腫瘤及其切緣組織中存在著分子邊界［2］。本研究利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學方法對大腸癌組織和癌周不同距離（距離腫瘤1、2、3 cm）組織p53、Ki67的表達進行分析，初步探討大腸癌手術(shù)切緣的分子邊界。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院病理科2007年9月至2008年1月間各類大腸癌組織和癌周不同距離組織（距離腫瘤1、2、3 cm）標本。所有病例臨床資料完整，標本均經(jīng)10％中性福爾馬林固定，常規(guī)處理后石蠟包埋。

1.2 主要試劑和儀器

p53兔抗人單克隆抗體工作液和Ki67鼠抗人單克隆抗體工作液購自北京中杉公司，組織微陣列打孔系統(tǒng)購自美國Beecher Instrument公司，組織芯片載體購自德國MenzelGlaser SuperFrostoPlus公司。

1.3 實驗方法

所有病例復診并在HE切片的典型部位作標記，將HE切片與供體蠟塊對照，在供體蠟塊相應位置作出標記并取樣，移植至受體蠟塊上，制成大腸癌組織和癌周不同距離（距離腫瘤1、2、3 cm）組織的組織芯片蠟塊；按同樣方法構(gòu)建另一個包含相同病例且陣列相同的組織芯片蠟塊以進行實驗重復；分別連續(xù)4 μm厚切片，制備成組織芯片備用。對組織芯片進行EnVision兩步法免疫組化染色，實驗步驟按試劑盒說明書進行，每個檢測指標均在另一張組織芯片上重復1次。統(tǒng)計分析p53、Ki67的表達情況。

1.4 結(jié)果評定

p53、Ki67蛋白均定位于細胞核，無背景著色情況下以細胞出現(xiàn)黃色顆粒者為陽性。綜合考慮染色強度和陽性細胞數(shù)，采用半定量積分法[3]判定免疫組化染色結(jié)果：計算陽性細胞百分數(shù)并賦予分值，≤5％為0分，6%～25％為1分，26%～50％為2分，51%～75％為3分，>75％為4分；觀察著色強度并賦予分值，無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩者相乘，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。同一病例的評分結(jié)果取平均值作為該病例的最終評分。

1.5 統(tǒng)計學處理

各組數(shù)據(jù)的比較采用KruskalWallis檢驗和Wilcoxon檢驗。

2 結(jié)果

2.1 p53的表達情況

p53在癌組織和癌周不同距離（距離腫瘤1、2、3 cm）組織表達的總體差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.000 1）（表1、圖1）；經(jīng)兩兩比較，癌組織和距離腫瘤1 cm組織、癌組織和距離腫瘤2 cm組織、癌組織和距離腫瘤3 cm組織（P<0.000 1）、距離腫瘤1 cm組織和距離腫瘤2 cm組織、距離腫瘤1 cm組織和距離腫瘤3cm組織（P<0.05）中p53的表達均有差異，但是距離腫瘤2 cm組織和距離腫瘤3 cm組織中p53的表達無差異（P>0.05）（表2）。表1 KruskalWallis檢驗p53在癌組織和癌周(距離腫瘤1、2、3 cm)組織中的表達

2.2 Ki67的表達情況

Ki67在癌組織和癌周不同距離組織（距離腫瘤1、2、3 cm）表達的總體差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.000 1）（表3，圖2）；經(jīng)兩兩比較，癌組織和距離腫瘤1 cm組織、癌組織和距離腫瘤2 cm組織、癌組織和距離腫瘤3 cm組織、距離腫瘤1 cm組織和距離腫瘤2 cm組織、距離腫瘤1 cm組織和距離腫瘤3 cm組織（P<0.000 1）、距離腫瘤2 cm組織和距離腫瘤3 cm組織（P<0.05）中Ki67的表達均有差異（表4）。表3 Ki67在癌組織和癌周(距離腫瘤1、2、3 cm)組織中表達的KruskalWallis檢驗

3 討論

惡性腫瘤手術(shù)治療的原則是徹底切除原發(fā)病灶，獲得陰性切緣。確立一個真正安全的手術(shù)切緣，對預防患者的局部復發(fā)和預后良好均有著重要的意義。常規(guī)病理學檢測出的癌細胞陽性切緣與切緣中僅有分子生物學變化者不同，后者僅有基因改變而無形態(tài)學改變，可能處于腫瘤發(fā)生的早期階段，這有可能成為腫瘤復發(fā)的根源。因此，確定腫瘤手術(shù)切緣的分子邊界可進一步提高手術(shù)切緣診斷的敏感性，對預防患者術(shù)后復發(fā)和評估預后都具有重要的意義。國內(nèi)邵根澤等［4］通過檢測食管癌手術(shù)切緣組織p53基因突變，首次提出了切緣分子邊界的概念。他們發(fā)現(xiàn)切緣組織p53基因突變患者預后差，其腫瘤復發(fā)率為46％；p53基因無突變者無一例復發(fā)，兩組復發(fā)率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示檢測切緣組織p53基因突變有助于食管癌手術(shù)評估和預后判斷。目前，胃癌［5］、肺癌［6］、前列腺癌［7］、膀胱癌［8］、子宮頸癌［9］等多種腫瘤手術(shù)切緣的分子邊界均被廣泛研究，但大腸癌手術(shù)切緣的分子邊界尚無研究報道。因此，本研究應用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學方法對大腸癌手術(shù)切緣的分子邊界進行初步研究。

p53是最常見的抑癌基因之一，位于人17p13.1，編碼相對分子質(zhì)量為53 000的蛋白質(zhì)。正常情況下，在DNA損傷后p53能將細胞阻滯在G1期，抑制細胞增殖，促進DNA修復。p53突變后則不能調(diào)控細胞增殖，使腫瘤細胞生長失控甚至侵襲力增加，導致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，且其突變幾乎見于所有的人類腫瘤中。Ki67是存在于增生細胞核的一種非組蛋白核蛋白，是一種與細胞增殖密切相關(guān)的核抗原，位于染色體10q25上，相對分子質(zhì)量為345 000。其功能與染色質(zhì)相連及與細胞的有絲分裂密切相關(guān)，被認為是較理想的檢測細胞增殖活性的指標，被廣泛應用于研究各種腫瘤患者的細胞增殖活性以及細胞周期與腫瘤的生長方式、浸潤方式、復發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學行為及預后的關(guān)系。我們對44例大腸癌患者癌組織和癌周不同距離（距離腫瘤1、2、3 cm）組織中p53、Ki67的表達情況進行了檢測，結(jié)果表明，p53和Ki67在大腸癌組織到癌周不同距離組織之間的表達強度呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢，該遞減表達具有統(tǒng)計學意義。提示在大腸癌周圍組織及切緣組織中存在分子邊界，在此邊界兩側(cè)基因的表達存在明顯差別，這種基因的差異表達是呈漸進性的，即隨著癌的發(fā)生基因表達逐漸增高或降低。對大腸癌手術(shù)患者切緣進行分子生物學檢測，確定其手術(shù)切緣的分子邊界，不僅能篩選出預后差的患者，更重要的是可以對這些患者進行及時的干預，以提高其生存率。明確大腸癌手術(shù)切緣的分子邊界對預防大腸癌患者術(shù)后復發(fā)和評估預后都具有重要的意義。

組織芯片（tissue chips）也稱組織微陣列（tissue microarrays，TMAs），是1998年由Kononen等在cDNA微陣列的基礎上發(fā)明的一種特殊的生物芯片，它是將數(shù)十個、數(shù)百個乃至上千個小的組織片整齊地排列在某一載體上而形成的微縮組織切片［10］。組織芯片具有體積小、信息含量高并可根據(jù)不同的需要進行組合和設計的特點，一次性實驗即可獲得大量結(jié)果。該技術(shù)將基因、蛋白水平的研究與組織形態(tài)學相結(jié)合，達到了高通量、多樣本的目的，減少了實驗誤差，提高了組織病理學研究的效率，使實驗結(jié)果有更可靠的可比性，并且為原始病理資料的保存和進行大樣本量的回顧性研究提供了可能［11］。每個組織芯片蠟塊可做100～200張的連續(xù)切片，可用同一種組織芯片對上百種分子標記物進行檢測、分析，可做特殊染色、免疫組化染色、原位雜交、熒光原位雜交等。本實驗應用組織芯片大規(guī)模檢測臨床組織樣本，具有快速、方便、經(jīng)濟、準確的特點。

多種基因異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展間存在著密切的相關(guān)性，組織芯片技術(shù)可高通量、多樣本地對腫瘤手術(shù)切緣處基因異常表達進行檢測，這不僅能從分子層面研究手術(shù)切緣的分子邊界，幫助人們進一步認識腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，還有助于革新腫瘤手術(shù)的治療方案，提高臨床治療效果，值得進一步深入探究。