作者：吉順莉， 李博， 李貞， 王成潤， 金一， 戈延茹

【關鍵詞】 脂質體納米粒; 藥物載體; 自組裝; 表征; 應用

脂質體納米粒 (Liposparticle)是一定濃度的脂質囊泡和納米粒分散在水溶液中自組裝形成的具有脂質外殼和納米粒核心的新型組裝體 (圖1)，近來，在生物科技和藥物、抗原、基因傳遞系統領域引起人們極大興趣[1]。脂質體納米粒具有以下特征[2]:①在溫和的條件下自發形成;②粒徑可控且結構穩定;③表面可以修飾;④載藥量高，貯存時間長，給藥前通過水化即可，防止藥物的降解和損失;⑤包封的藥物可以持續釋放。脂質體納米粒這種結構結合了納米粒和脂質體的優點[3]，納米粒核心可作為支撐骨架，賦予脂質層機械穩定性、可控的形態學、狹窄的粒徑分布和最終材料的純化。結合生物可降解的材料，粒子還可用于體內作為生物活性化合物的載體。而外周的脂質膜具有生物相容性，生物膜的擬生態行為(黏附，融合……)，在膜內或膜表面可與多種分子(脂溶性的或者水溶性的)相互作用，因此可作為不同生物分子的載體。生物載體治療公司[4] 最先研究了一種基于交聯的云芝多糖陽離子納米粒(60 nm)外面包裹磷脂和膽固醇的混合物的系統，可用于疫苗和藥物傳遞[5]。Rapuano等[6]對不同的支持物上的雙分子層進行了研究，包括二氧化硅粒子、聚苯乙烯粒子和聚甲基異丁烯酸粒子，從吸附等溫線、粒徑、表面電荷、膠體穩定性和生物分子識別等幾個方面研究了脂質包裹的納米粒。近年來，國外對脂質體納米粒及其載藥制劑的研究越來越多，脂質體納米粒自組裝成的這種獨特核殼結構也正成為制劑載藥系統研究的熱點之一，但國內研究報道較少。因此，本文通過查閱國內外相關文獻，對脂質體納米粒載藥系統的最新研究進展進行綜述。

1 脂質體納米粒的構成材料及結構形式

脂質體是一種眾所周知的制劑，已有廣泛應用。當磷脂分散在水中時形成多層囊泡，并且每一層均為脂質雙分子層。目前，脂質材料有中性脂質二棕櫚酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC)、二硬脂酰膽堿(distearoyl phosphatidylcholine， DSPC)和二肉豆蔻酰磷酸酰膽堿(dimyristoyl phosphatidyl choline， DMPC);負電荷脂質有磷脂酸(phosphatidic acid， PA)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine， PS)和雙鯨蠟磷酸酯(dicetaceumphosphate， DCP);正電荷脂質有N[1(2，3二油酰基)丙基]N， N， N三乙胺氯(N[1(2， 3dioleyloxy)propyl]N，N，Ntrimethylammonium chloride， DOTMA)、2，3二油酰基N[2(精氨酸基酰胺)乙基]N，N二甲基1丙基三氟乙酸胺(2，3dioleyloxyN[2(sperminecarboxyamido)ethyl]N，Ndimethyllpropanaminium trifluroacetate， DOSPA)、1，2二油酰氧丙基N，N，N三甲基溴化銨(1，2dipalmitoyl3trimethylammoniumpropane，DPTAP)等[7]。脂質體納米粒的核心為不同粒徑和性質的球形固體支持物。目前報道中，使用最多的無機物是二氧化硅粒子[8]。而在有機聚合物支持物的選擇中，聚苯乙烯粒子使用得最多，是因為通過它比較容易得到粒度分布狹窄的膠體懸液[3，9]。此外還有一些研究使用的是生物環境下可完全降解的多糖核心，如糊精麥芽糖復合劑[10]和殼聚糖[11]，或生物可降解的脂肪族聚酯核心，如聚乳酸[12]。

脂質體納米粒的形成是基于納米粒與脂質膜之間的相互作用。將脂質囊泡與納米粒溶液在一定溫度下孵育，囊泡接觸到納米粒子以后產生融合作用，在納米粒子的周圍重組成連續的雙分子層。Gilbert等[13]最先發明了“脂質呈遞系統”，它將脂質吸附在所謂的玻璃微球表面上(直徑≈1.6 μm)。為了檢測脂質確實包裹著微球，在磷脂組成中摻入熒光探針[14]，通過熒光顯微鏡觀察到粒子周圍有均勻的熒光殼，表明脂質沉積在粒子表面，并且形成的脂質膜連續均勻。另外Bershteyn等[15]研究發現，包封納米粒所用的脂質的量和組成不同也會導致最終的脂質體納米粒系統外層形成多種脂質結構，如殼狀、洋蔥狀或花瓣樣。當脂質中摻入聚乙二醇化的脂質時，可以觀察到花瓣狀的脂質雙分子層從聚合物核心向外延展[11](圖2)，而不同結構粒子的細胞攝取率也相差很大。

a，b:二油酰磷脂膽堿(dioleoylphosphocholine， DOPC)脂質包裹的粒子時呈現“洋蔥”狀形態，多層脂質呈圓環狀堆疊在粒子核心周圍;c，d:當DOPC脂質摻入10%摩爾的聚乙二醇磷脂時，形成脂質“花朵”，“花瓣”從聚合物核心向外延展

圖2 脂質的量和組成不同形成不同結構

2 脂質體納米粒的制備

2.1 脂質體納米粒的制備方法

脂質體納米粒的制備，可以通過兩種方法實現。第一種方法是直接將旋干的脂質膜與分散的納米粒溶液水合(圖3a)，但這種方法費時[16]，即使用相對合適的參數控制制備過程，還是不能控制最終的粒徑及粒度分布。第二種方法是將事先制備好的囊泡與納米粒溶液混合(圖3b)，這種方法方便簡單，易于控制粒徑[17]。制備囊泡的不同方法有:①水合法;②水浴超聲;③擠出法。而每種方法形成囊泡的粒徑和均一性都不同，直接用旋干的脂質膜和用水合法形成的囊泡制備的脂質體納米粒結果最差，而用擠出法制備的囊泡來制備的脂質體納米粒最好。囊泡的粒徑和粒度分布越小，越具有可控性和重復性。大的多層囊泡與小的單層囊泡相比，脂質在納米粒表面的重組更加困難。

2.2 脂質體納米粒制備的影響因素

2.2.1 連續相理化性質的影響 連續相的選擇對脂質體納米粒的制備至關重要。為了考察連續相對脂質體納米粒制備的影響，Troutier等[3]以聚苯乙烯粒子為支持物模型，考察了緩沖液類型、離子強度和緩沖液pH值對不同電荷的囊泡與聚苯乙烯粒子構成脂質體納米粒粒徑的影響。結果表明，離子強度和pH值相同的不同種類的緩沖液對組裝過程沒有顯著差異，說明脂質體納米粒組裝過程不受離子種類的影響。pH值的變化對脂質體納米粒的組裝過程也沒有影響，因為DPPC在強酸至強堿范圍內均為兩性脂質，而DPTAP脂質的季銨基團使其對pH值變化不敏感。不同離子強度對陽離子和兩性脂質囊泡的組裝過程影響差異較大，對于陽離子脂質，高離子強度下制備使其電荷被屏蔽，容易聚集;而在低離子強度下制備好的脂質體納米粒即使再置于高離子強度下也不發生聚集。這個現象說明囊泡和粒子之間的相互作用比制備好的脂質體納米粒更容易受離子強度的影響。對于兩性脂質，由于脂質體納米粒的組裝主要不是通過靜電相互作用，因此離子強度的作用不突出。

2.2.2 脂質成分電荷的影響 脂質體納米粒組裝過程中，陽離子脂質成分百分比較低時粒徑增大。Makino等[18]解釋，DPPC頭基可能顯露了其陰離子部分而伸向外側，由于DPPC/DPTAP的靜電相互作用導致粒子聚集。隨著DPTAP百分比的增加，靜電斥力占優勢，從而使組裝體的粒徑減小。在100%陽離子脂質成分的組裝體中，多分散性很小，這表明脂質體納米粒均為單個粒子，其粒徑接近于空白粒子包裹著單個脂質雙分子層。在100%兩性脂質構成的脂質體納米粒中，也未發生聚集，粒徑和粒度分布都接近空白粒子，因為DPPC分子間缺少靜電相互作用，從而避免了其聚集。

2.2.3 囊泡/粒子表面積比值的影響 影響脂質體納米粒制備的另一個因素是最初的混合物中脂質囊泡與粒子的表面積比值，AV/AP(AV和AP分別是脂質囊泡和粒子的總表面積)，這個概念由CarmonaRibeiro等[19]最先提出。對于0 %，75 %，和100 %的DPTAP脂質組成，脂質體納米粒的粒徑和粒度分布不受AV/AP的影響，接近于空白粒子。而其他百分比(如10 %，25 %和50 %DPTAP)，隨著AV/AP的增大，脂質體納米粒的粒徑逐漸減小。對于這部分比例的DPTAP，囊泡在AV/AP高時發揮靜電穩定劑作用，而在AV/AP低時發揮促凝劑作用。AV/AP較低時發生聚集基于兩種假設[3]:①在陽離子囊泡和陰離子粒子之間形成橋梁(局部“過剩”);②由于AV/AP較低，粒子沒有完全被包裹，粒子的陰離子區域顯露。而對于0% DPTAP，在所有范圍的AV/AP比值中均不發生聚集。這也可用兩種假想來解釋:①陰離子粒子和略微負電荷的囊泡中沒有形成橋;②在DPPC不完全覆蓋的陰離子粒子間沒有發生靜電吸引。

3 脂質體納米粒的表征

脂質體納米粒組裝體具有核殼結構，這種組裝體可通過多種方法，從粒徑、表面電荷、化學組成和形態等多個方面進行表征。

3.1 粒徑和Zeta電位測量

粒徑測定和Zeta電位測量可以說明脂質的有效吸附[20]。納米粒表面被脂質膜包裹以后直觀表現在粒徑的略微增大。與帶相反電荷的囊泡相互作用以后，納米粒表面的電荷信號改變足以證明了聚苯乙烯納米粒表面負電荷被陽離子脂質屏蔽。

3.2 X射線光電子光譜法(XPS)

XPS技術提供了一種新方法來表征包裹的脂質[3]。將DPPC脂質構成的脂質體納米粒與空白聚苯乙烯納米粒的XPS光譜相比，聚苯乙烯粒子的特征信號π→π*(292 eV處)消失，并且組裝體表面的各種碳原子所占的百分比與DPPC的理論值接近，O/P(原子百分比)為7.6，接近DPPC的理論值8，從而證實粒子被脂質層所包裹。

3.3 顯微鏡技術

通過顯微鏡技術可得到組裝體表面包裹的全部信息。為粒子和囊泡分別選擇兩種不同的熒光基團，若粒子的熒光信號與脂質信號重合說明粒子與脂質處于同一位置，粒子的熒光信號被脂質熒光信號覆蓋進一步驗證粒子被脂質所包裹。

3.4 超薄切片透射電子顯微術(TEM)

將樣品包埋于樹脂中，可避免以往干燥過程中導致的目標物重排。包埋樣品的切片通過TEM重點對粒子和染色脂質的電子云密度進行比較。將事先染色、包埋于樹脂中的空白聚苯乙烯粒子和脂質體納米粒進行超薄切片觀察，與空白粒子相比，脂質體納米粒影像顯示粒子被一圈均一而深色的殼所包圍，表明脂質層包裹著納米粒。

3.5 差示掃描量熱分析(DSC)

對包裹有兩性脂質和陽離子脂質的納米粒分別進行差示掃描量熱分析。DSC結果顯示都只出現了一個躍遷峰，這表明脂質形成了一個有序相，而不是以單分子吸附在支持物上而出現，這從一定程度上說明脂質包裹均一。

3.6 凍結蝕刻電子顯微鏡

這一技術允許在水合狀態下觀察樣品，避免了傳統方法造成的假象(樣品干燥過程中結構變形)[21]。二氧化硅納米粒的cryoTEM圖像顯示，由于粒子的微孔性出現了電子致密核。加入囊泡以后，脂質殼呈現出一個持續而均勻的雙分子層，準確地出現在粒子輪廓上。

4 脂質體納米粒作為藥物載體的應用

4.1 藥物靶向

納米粒表面連接腫瘤壞死因子(TNF)后，可以作為有效的載體系統，激活TNF受體從而誘導細胞凋亡。但是由于潛在的全身毒性，體內應用受到阻礙。Messerschmidt等[22]將TNF納米粒作為模型系統，在其外面包裹一層脂質膜，這樣可以將TNF的活性暫時屏蔽，形成內部為單鏈TNF官能化的納米粒;外層的脂質膜PEG化賦予其立體穩定性，并用單鏈抗體可變區基因片段(scFc)修飾，用于靶向有FAP(一種抗癌基因)標記的腫瘤間質。脂質包裹以后明顯降低對FAP陰性細胞的細胞毒性，而對FAP陽性細胞的細胞毒性增加。通過脂質體包封，納米粒裝載生物活性分子，可以靶向特異性細胞。這種新型組裝體除了安全性和靶向性，還適用于多種診斷和治療，可將試劑包埋在納米粒核心或分布于粒子表面，從而有利于靶向遞藥。

4.2 聯合用藥

腫瘤的多藥耐藥性需要細胞毒藥物與化學敏感劑共同給藥，而脂質體納米粒系統可以同時包封多種藥物。為了優化這種結合給藥的效果，Wong等[23]將GG918特異的P糖蛋白抑制劑和多柔比星細胞毒藥物這兩種藥物體外對耐藥株乳腺癌細胞分別以溶液和脂質體納米粒形式給藥。結果表明，以脂質體納米粒形式給藥的治療效果最顯著，它能顯著提高細胞對多柔比星的攝取與滯留時間。與溶液組相比，脂質體納米粒組對腫瘤細胞的抑制作用增加了8倍。脂質體納米粒系統提供了一種改善抗藥腫瘤治療效果的最佳、有效的途徑。

4.3 作為基因治療藥物載體

脂質體納米粒系統由于其有很好的生物相容性和體內穩定性，可以用作質粒 DNA和寡核苷酸的載體。Li等[24]研究了雙十八烷基二甲基溴化銨(dioctadecyldimethylammoniumbromide， DODAB)脂質包裹的金納米粒對哺乳動物細胞轉染的介導作用。研究表明，DODAB脂質雙分子層包裹金納米粒以后，可以有效地將DNA質粒成功轉染到HEK 293細胞中去。DODAB脂質包裹的金納米粒的轉染效率是DODAB脂質的5倍。脂質體納米粒的出現為構造金納米粒作為基因載體和納米材料用于轉染提供了一種新途徑。

4.4 作為眼科藥物載體

Diebold等[11]對脂質體殼聚糖納米粒組裝體(liposomechitosan nanoparticle complexes， LCSNP)作為眼科藥物載體進行了研究。結果表明，LCSNP首先滯留在黏液層，然后不同程度地進入結膜細胞，并且其在體外未表現出細胞毒性，體內耐受性較好。總之，通過進一步研究，將來LCSNP可通過眼睛黏膜用于藥物傳送。

5 結語與展望

脂質體納米粒系統作為給藥載體具有突出的優勢，它將脂質體與納米粒的優點結合起來，具有很高的藥物包封率、可調節的持續釋放行為和良好的血清穩定性，可用于多種細胞和組織靶向。脂質體納米粒組裝體的核殼結構，使其內核可以作為疏水性藥物的容器，外殼可對藥物起保護作用，并且達到緩釋作用。同時通過對脂質體納米粒的表面修飾可以達到靶向作用。脂質體納米粒這種非病毒載體沒有免疫原性，不會引起細胞的免疫反應，將其包裹以后，可以保護基因類藥物免受酶的降解到達細胞內，有望作為生物藥物載體。相信隨著研究的不斷深入，脂質體納米粒系統必將成為人類征服疾病的又一有力工具。