作者：林娜，高靜，方春錢，張海峰，楊永建，顧亞君，郭文潔

【摘要】 目的： 研究積雪草酸（asiatic acid，AA）與化療藥物環(huán)磷酰胺（CTX），5氟尿嘧啶（5Fu）聯(lián)用的抗腫瘤作用。方法： 采用在體與離體實驗相結(jié)合的方法，觀察AA與5Fu或CTX聯(lián)用對肝癌細胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、實體瘤生長的影響。用MTT法檢測聯(lián)用AA和5Fu的抗腫瘤效果。結(jié)果： 10，15，20，25 μmol/L AA與50，7.5，1 μmol/L 5Fu聯(lián)用，具有顯著的抗腫瘤作用，AA不降低5Fu對HepG2細胞增殖的抑制作用。AA和CTX聯(lián)用于Heps腹水瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)AA（50，100 mg/kg）和CTX（20 mg/kg）聯(lián)用與單用CTX一樣，能抑制腹腔積液的增生，且可延長Heps腹水瘤小鼠的壽命；AA和CTX聯(lián)用于Heps實體瘤小鼠，有明顯的抑瘤作用，而且AA能對抗CTX誘導(dǎo)的谷胱甘肽（GSH）水平的降低，可能對肝臟的抗氧化能力有一定的保護作用。結(jié)論： AA與化療藥物聯(lián)用，可以減弱化療藥物的毒副作用。

【關(guān)鍵詞】 積雪草酸； 5氟尿嘧啶； 環(huán)磷酰胺； 聯(lián)合用藥； 抗腫瘤

［Abstract］Objective: Study the antitumor effects of asiatic acid（AA）combined with chemotherapeutics cyclophosphamide(CTX) or 5fluorouracil(5Fu). Methods： The cytotoxic effects of the combination of AA and 5FU on tumor cell lines HepG2 were detected by MTT assay.Mice transplanted with Heps solid tumor and ascites carcinoma were used to study the combination antitumor effect of AA(50，100 mg/kg) and CTX(20 mg/kg). Results： When AA(10， 15， 20， 25 μmol/L) and 5Fu(50， 7.5， 1 μmol/L) was combinated to treat the cells， the growth of HepG2 cells were inhibited obviously. On the other hand， AA prolonged the survival time of mice with Heps ascites carcinoma compared with those in CTX group and showed significant antitumor activity simultaneously. The protection of AA on hepatic GSH level insulted by CTX in mice with Heps solid tumor treated with AA and CTX confirmed the attenuated toxicity effects of AA， which might be associated with hepatopretection of AA. Conclusion： The present data suggest that AA attenuate the toxicity of some chemotherapeutics and may be helpful in cancer treatment with the combination of chemotherapeutics. ［Key words］ asiatic acid; 5fluorouracil; cyclophosphamide; drugcombination; antitumor

腫瘤已成為人類致死的三大疾病之一。目前臨床使用的環(huán)磷酰胺（CTX），5氟尿嘧啶（5Fu）等抗腫瘤藥物化療時均產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，引起正常組織的多器官毒性、免疫抑制、反復(fù)感染， 機體衰弱等現(xiàn)象［1， 2］。本實驗室已有的研究也發(fā)現(xiàn)CTX通過影響小鼠肝臟線粒體功能從而導(dǎo)致肝損傷［3］。我國一些傳統(tǒng)中藥因其較少的不良反應(yīng) 、對機體具有保護和調(diào)理作用， 成為中西藥聯(lián)合化療的研究熱點。研發(fā)新型抗腫瘤增效、減毒劑可能是戰(zhàn)勝惡性腫瘤的途徑之一［4］。 積雪草酸（asiatic acid，AA），又名亞細亞酸，是我國傳統(tǒng)中藥積雪草的五環(huán)三萜類組分之一。經(jīng)研究證明，AA具有促進成纖維蛋白合成［5， 6］、對抗CCl4和DGalN誘導(dǎo)的肝損傷［7］、對抗神經(jīng)細胞的氧化損傷［8］等細胞保護作用。另外，也發(fā)現(xiàn)AA具有抑制腫瘤細胞增殖的作用［9， 10］。但是對于AA應(yīng)用于在體抗腫瘤治療的實驗研究尚未見報道。本研究將在體與離體實驗相結(jié)合，觀察了AA與5Fu或CTX聯(lián)用對肝癌細胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、實體瘤生長的影響。 1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞株（HepG2）：南京大學徐力致老師惠贈；ICR小鼠（雄性），體質(zhì)量18～22 g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心，合格證號：SCXK（蘇）2002－0009。動物飼養(yǎng)晝夜循環(huán)為10/14 h，環(huán)境溫度為25℃左右，自由飲食進水；Heps腹水瘤種鼠源自江蘇省腫瘤醫(yī)院；MTT（Sigma公司）；5Fu（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；積雪草酸，純度95%（廣西昌洲天然產(chǎn)物有限公司），用于在體實驗的AA用β環(huán)糊精包埋，由江蘇大學化學化工學院張蓉仙老師制備；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：國藥準字H32020857）；β環(huán)糊精（南京中脈遠紅股份有限公司謝家坤高工惠贈）；谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 離體實驗

1.2.1 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞培養(yǎng)于含10 %小牛血清的MEM培養(yǎng)基。細胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5 % CO2的孵箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.2.2 實驗分組

將處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板，接種密度為2×104 個/ml，每孔100 μl。培養(yǎng)24 h后，加入10，20，30，40 μmol/L AA，48 h后用檢測細胞活性，分析AA對HepG2細胞增殖的影響。采用50，7.5，1 μmol/L的5Fu分別與不同濃度AA（10，15，20，25 μmol/L）聯(lián)合用藥。以含1‰ DMSO的培養(yǎng)基為對照。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率

96孔培養(yǎng)板中細胞經(jīng)藥物處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μl MTT（Dhank′s液溶解，1 mg/ml），37℃孵育4 h后，吸去上清，每孔加DMSO 100 μl，待結(jié)晶物充分溶解，用酶標儀（Spectrum 190，Moleculer Devices）于570 nm處測光密度值。

1.3 在體實驗

1.3.1 荷瘤小鼠模型

Heps腹水瘤模型:取Heps腹水瘤小鼠，處死后浸泡于75%乙醇5 min，腹腔穿刺取腹腔積液，計數(shù)稀釋至1×107個 /ml，取0.2 ml腫瘤細胞懸液接種于ICR小鼠腹腔。Heps實體瘤模型：同Heps腹水瘤模型，制備2×107個/ml的Heps瘤細胞懸液，0.2 ml/只，接種于ICR小鼠右側(cè)腋下。

1.3.2 實驗分組

荷瘤小鼠隨機分為5組，對照組、CTX組、低劑量AA和CTX聯(lián)用組、高劑量AA和CTX聯(lián)用組及高劑量AA組，每組10 只。于腹腔接種瘤細胞的次日開始給藥，聯(lián)合用藥組每日皮下注射CTX（20 mg/kg）并分別灌胃低劑量（50 mg/kg）和高劑量（100 mg/kg）AA；CTX組皮下注射CTX（20 mg/kg），以等量環(huán)糊精灌胃作為對照；高劑量AA組灌胃高劑量AA（100 mg/kg），皮下注射等量生理鹽水。對照組皮下注射等量生理鹽水，灌胃等量環(huán)糊精。

腹水瘤小鼠存活率檢測分3組：對照組，20 mg/kg CTX組，50 mg/kg AA和20 mg/kg CTX聯(lián)用組。

1.3.3 腹水瘤小鼠存活率分析

觀察小鼠的存活情況，并記錄每天存活小鼠只數(shù)，進行生存期比較。存活率=存活小鼠/小鼠總數(shù)×100%

1.3.4 實體瘤小鼠抑瘤率檢測

給藥15 d后，小鼠眼底靜脈叢取血，然后頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，稱重，計算腫瘤抑制率。

1.3.5 肝臟GSH含量檢測

取肝臟左大葉相同部位肝組織，用適量生理鹽水制備成10%組織勻漿，試劑盒檢測GSH含量。

1.4 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)運用SAS軟件進行單因素方差分析（ANOVA），組間比較作SNKq檢驗。顯著性標準為α＝0.05。腹水瘤小鼠存活率比較用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 AA對腫瘤細胞增殖的影響

如圖1所示，AA的劑量小于20 μmol/L時，對HepG2細胞的生長沒有明顯影響；當劑量達到30 μmol/L時，細胞活性顯著降低；隨著劑量的繼續(xù)加大，抑制細胞增殖的作用逐漸加強。

2.2 AA和5Fu聯(lián)用抑制腫瘤細胞增殖

采用10， 15，20，25 μmol/L的AA，分別與50，7.5，1 μmol/L 5Fu聯(lián)用。結(jié)果如圖2所示。隨著5Fu濃度的降低，5Fu和AA聯(lián)用的抗腫瘤效果也逐漸降低。10， 15，20，25 μmol/L 的AA和5Fu聯(lián)用后抗腫瘤趨勢與單用5Fu的趨勢一致。說明AA對3個濃度 5Fu的抗腫瘤效果均沒有影響。

2.3 AA與CTX聯(lián)用對Heps腹水瘤小鼠存活率的影響

由圖3可以看出： CTX組小鼠出現(xiàn)死亡較早，和AA聯(lián)用后，死亡延緩。說明AA有降低CTX毒性，延長荷瘤鼠壽命的作用。 接種腫瘤后第14天荷瘤小鼠存活率統(tǒng)計分析表明，20 mg/kg CTX組小鼠的存活率低于對照組，說明CTX抑瘤的同時產(chǎn)生了明顯的毒性作用；而AA與CTX聯(lián)用組小鼠的存活率有所提高，提示AA有延長荷瘤小鼠壽命、降低CTX毒性的作用（表1）。表1 化療第14天各組荷瘤鼠的存活率（略）

2.4 AA與CTX聯(lián)用抑制Heps實體瘤的作用 由圖4可以看出：20 mg/kg CTX對Heps實體瘤具有良好的抑制作用，單用100 mg/kg AA 的抗腫瘤活性較弱，兩者聯(lián)用后具有顯著的抗腫瘤作用，50，100 mg/kg AA均沒有減弱CTX的抗腫瘤活性。 2.5 AA與CTX聯(lián)用對荷瘤小鼠抗氧化能力的影響

從圖5可以看出：CTX組荷瘤小鼠肝組織中GSH含量顯著下降，而AA和CTX聯(lián)用組GSH含量和對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，說明AA對抗了CTX 誘導(dǎo)的荷瘤小鼠肝臟GSH水平的降低。

3 討論

AA對不同腫瘤細胞具有不同的抗腫瘤機制［9，10］，低劑量時則可以保護細胞對抗損傷［5，7］。本研究首次將AA應(yīng)用于中西藥聯(lián)合化療，通過AA和5Fu聯(lián)用，觀察體外聯(lián)合用藥的效果；AA和CTX聯(lián)用，觀察在體抗腫瘤的效果。結(jié)果表明，選擇合適的劑量，可以使AA在不影響抗腫瘤藥物作用的前提下，發(fā)揮其細胞保護作用。 之前有文獻報道：在CTX引起的肝毒性過程中，自由基和氧化應(yīng)激是兩個不可忽視的因素，兩者導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的劇烈進行，胞內(nèi)抗氧化防御體系通過非酶促反應(yīng)清除自由基，GSH 迅速耗竭［11］。從Heps實體瘤模型結(jié)果可知， AA對抗CTX誘導(dǎo)的肝臟GSH活性的降低，提示AA對肝臟具有保護作用，這與以前的研究結(jié)果一致［8］。 AA單獨應(yīng)用沒有發(fā)揮理想的抑瘤作用，而影響藥物作用的因素很多，且由于實驗中觀察到AA的水溶性不好，我們推測生物利用度不高可能是重要的影響因素之一。因此也許通過改變AA的劑型，使其在體內(nèi)能達到抗腫瘤的血藥濃度，可以進一步研究AA的在體抗腫瘤效果，為AA 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。