作者：鄭鴻燕 邰浩清 ，曾水林

【摘要】 目的:觀(guān)察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)耳蝸干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性耳聾大鼠增效作用。方法:感音神經(jīng)性耳聾大鼠分為耳蝸干細(xì)胞移植組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯組和空白對(duì)照組3組。體外培養(yǎng)耳蝸干細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)耳移植，耳蝸干細(xì)胞移植組將耳蝸干細(xì)胞懸液移植入內(nèi)耳耳蝸結(jié)構(gòu)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組將含有當(dāng)歸補(bǔ)血湯的耳蝸干細(xì)胞懸液移植入內(nèi)耳耳蝸結(jié)構(gòu)，空白對(duì)照組移植生理鹽水。分別于術(shù)后1、3、6和12個(gè)月采用聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位方法檢測(cè)模型大鼠的聽(tīng)力恢復(fù)情況，處死大鼠，通過(guò)免疫熒光染色方法觀(guān)察移植的耳蝸干細(xì)胞在內(nèi)耳存活、分化和遷移情況。結(jié)果:從E14大鼠耳蝸分離的組織，經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)后，可獲得大量未分化懸浮生長(zhǎng)的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)， Brdu表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明是具有自我更新和增殖潛能的干細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在耳蝸干細(xì)胞移植組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯組在移植針道兩側(cè)可見(jiàn)移植的干細(xì)胞，有些還遷移到基底膜區(qū)。存活的細(xì)胞部分呈 Myosin Ⅶ A陽(yáng)性染色。與耳蝸干細(xì)胞移植組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組 Myosin Ⅶ A陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位結(jié)果顯示當(dāng)歸補(bǔ)血湯組的感音神經(jīng)性耳聾模型大鼠聽(tīng)力恢復(fù)情況較耳蝸干細(xì)胞移植組和對(duì)照組好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：經(jīng)體外培養(yǎng)的耳蝸干細(xì)胞移植入內(nèi)耳鼓階后能夠存活和遷移，并分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞;當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以提高耳蝸干細(xì)胞分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞的比例，并促進(jìn)感音神經(jīng)性耳聾模型大鼠聽(tīng)力恢復(fù)。

【關(guān)鍵詞】 耳蝸干細(xì)胞; 移植; 當(dāng)歸補(bǔ)血湯; 大鼠

[Abstract] Object: To investigate the effect of astragalus membranaceus and angelica sinensis on implantation of stem cells from cochlea for management of hearing loss. Methods: The hearing loss model rats were pided into cochlea stem cells group， astragalus membranaceus and angelica sinensis group， control group. Cochlea stem cells were isolated and cultured by using serum free medium. Cochlea stem cells were grafted into the rats cochlea regions in cochlea stem cells group， both cochlea stem cells and astragalus membranaceus and angelica sinensis were grafted into the ratss cochlea regions in astragalus membranaceus and angelica sinensis group， and saline were grafted into the ratss cochlea regions in the control group. The hearing recovering of the hearing loss model rats were measured by brain stem auditory evoked protential on 1， 3， 6 and 12 months after implantation. Immunofluorescence was used to detect the results of stem cells survival， differentiation and migration. Results: The dissociated cells from the newborn rat organ of corti developed into much of indiffrentiated otopheres of nestin(+) cells when plated on a nonadherent substratum. Within cultured otospheres， Brdu(+) cells were rapidly risen to newly formed otopheres. Myosin ⅦA(+) hair cells were detected by immunofluorescence on both side of implantation area in cochlea stem cells group and astragalus membranaceus and ngelica sinensis group， some of Myosin ⅦA(+) hair cells migrated to basal membrane area. The number of Myosin ⅦA(+) hair cells was much more in astragalus membranaceus and angelica sinensis group than in other groups(P<0.05). The hearing recovering of the hearing loss was better in astragalus membranaceus and angelica sinensis group than in other groups(P<0.05). Conclusion: Cochlea stem cells could survive， differentiate and migrate after implantation into the hearing loss model rats. Astragalus membranaceus and angelica sinensis could increase the number of Myosin ⅦA(+) hair cells and accelerate hearing recovering of the hearing loss model rats.

[Key words] cochlea stem cells; implantation; astragalus membranaceus and angelica sinensis; rats

噪聲、抗生素和年齡引起的毛細(xì)胞壞死是聽(tīng)力損傷的主要原因。傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為毛細(xì)胞損傷后無(wú)法再生，相關(guān)組織也無(wú)法進(jìn)行功能重建，所以這種聽(tīng)力損害是永久性的。內(nèi)耳毛細(xì)胞再生和修復(fù)一直是近年來(lái)聽(tīng)力學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。利用耳蝸神經(jīng)干細(xì)胞移植技術(shù)，使變性壞死的內(nèi)耳毛細(xì)胞再生，有可能成為治療耳聾的新手段。在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)耳蝸部位進(jìn)行了耳蝸干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定[1]，研究發(fā)現(xiàn)耳蝸干細(xì)胞經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)分化后，可分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可提高體外培養(yǎng)的耳蝸干細(xì)胞向內(nèi)耳功能細(xì)胞的分化比例[2]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是中藥傳統(tǒng)經(jīng)典組方，實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞[3]、脾樹(shù)突狀細(xì)胞[4]、造血祖細(xì)胞[5]等具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其分化等影響。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是否會(huì)對(duì)移植耳蝸干細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生影響呢?本實(shí)驗(yàn)對(duì)耳蝸干細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行內(nèi)耳移植，同時(shí)采用中藥當(dāng)歸補(bǔ)血湯進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位方法檢測(cè)模型大鼠的聽(tīng)力恢復(fù)情況，免疫熒光染色方法觀(guān)察移植的耳蝸干細(xì)胞在內(nèi)耳存活、分化和遷移情況以及當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)耳蝸干細(xì)胞增殖分化的影響，為進(jìn)一步研究中藥干預(yù)耳蝸干細(xì)胞移植和定向分化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 E14大鼠由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和抗體 Neurobasal培養(yǎng)基、B27輔助培養(yǎng)基(GIBCO公司)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Sigma公司)、胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料研究所)、多聚賴(lài)氨酸(Sigma公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、巢蛋白(Nestin)抗體、Brdu及其單克隆抗體(Sigma公司)、Myosin Ⅶ A抗體(Sigma公司)。

1.1.3 主要儀器 離心機(jī)(Centrifuge 5417R，德國(guó)Eppendorf公司)、超凈工作臺(tái)(凈化等級(jí)100級(jí)，吳江市凈化設(shè)備總廠(chǎng))、恒溫水浴箱(SHAC，金壇市恒豐儀器廠(chǎng))、倒置相差顯微鏡(OLYMPUSCK2，日本OLYMPUS公司)、熒光顯微鏡(BX60 F5，日本OLYMPUS公司)。

1.2 耳蝸干細(xì)胞取材、培養(yǎng)和鑒定

乙醚麻醉E14大鼠，取出內(nèi)耳耳蝸。分離Corti器，HBSS液沖洗3次后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶37 ℃消化30 min。吸管輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。以1×105 ml-1的細(xì)胞密度移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每隔3 d半量置換培養(yǎng)基。培養(yǎng)7～9 d后，機(jī)械分離神經(jīng)球進(jìn)行傳代。具體操作方法見(jiàn)

1.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清制作

當(dāng)歸補(bǔ)血湯配方比例為黃芪 ∶當(dāng)歸=5 ∶1，藥物組大鼠在1～3 d早晚各給藥2 ml·(100 g)-1，第4天一次服用全天劑量，采血前禁食12 h，末次給藥2 h后采血。取血后分離血清，56 ℃滅活30 min，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩＞唧w配制方法見(jiàn)

1.4 細(xì)胞核標(biāo)記

移植前24 h，將Brdu溶于無(wú)血清培養(yǎng)基中，避光備用。吸干培養(yǎng)基，加入Brdu溶液，避光孵育60 min，用Hanks液沖洗去除未結(jié)合Brdu，熒光顯微鏡觀(guān)察。Brdu標(biāo)記的是具有增殖特性的干細(xì)胞的細(xì)胞核。采用0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)整密度至1.0×106 ml-1懸浮于1 ml無(wú)血清培養(yǎng)基中備用。

1.5 感音神經(jīng)性耳聾模型建立

選擇聽(tīng)力正常雄性健康大鼠，體質(zhì)量180～200 g，耳廓反射陽(yáng)性，無(wú)強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，未發(fā)現(xiàn)中耳炎。50 mg·kg-1硫酸慶大霉素腹腔注射，早晚各1次，每日檢測(cè)腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位1次，以閾值下降30 dB的聽(tīng)力損失為停藥指標(biāo)。

1.6 耳蝸干細(xì)胞移植

將大鼠感音神經(jīng)性耳聾模型分為3組，即耳蝸干細(xì)胞移植組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯組及對(duì)照組，每組40只大鼠。耳蝸干細(xì)胞移植組將耳蝸干細(xì)胞懸液移植入大鼠內(nèi)耳耳蝸結(jié)構(gòu);當(dāng)歸補(bǔ)血湯組將含有當(dāng)歸補(bǔ)血湯的耳蝸干細(xì)胞懸液移植入大鼠內(nèi)耳耳蝸結(jié)構(gòu);對(duì)照組大鼠移植生理鹽水。乙醚麻醉大鼠，耳蝸底周鼓階鉆孔，采用微推進(jìn)器向鼓階外淋巴腔導(dǎo)入細(xì)胞，每只豚鼠只作右耳。取耳后切口，暴露聽(tīng)泡骨質(zhì)，打開(kāi)聽(tīng)泡，距圓窗龕約1.0 mm處耳蝸底周鼓階外側(cè)壁下方，磨一直徑約0.2 mm小孔，由鼓階造孔處緩緩注入10 μl細(xì)胞懸液或生理鹽水，注射速度0.5 μl·min-1。注射完畢留針5 min。注射完畢后，肌漿組織封堵造孔，逐層縫合皮膚切口。術(shù)前5 d至術(shù)后7 d皮下注射地塞米松和肌肉注射青霉素，以預(yù)防中耳感染。

1.7 腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位測(cè)定

用誘發(fā)電位儀在隔音屏蔽室內(nèi)測(cè)定清醒狀態(tài)下的大鼠腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位。用固定裝置固定大鼠，引導(dǎo)電極置于顱頂部，參考電極及接地電極分別置于同側(cè)和對(duì)側(cè)乳突部。用短聲刺激，由聲刺激器輸入波寬為0.1 ms方波電脈沖，經(jīng)EDL903型耳機(jī)輸出，10 次·s-1。放大器通頻帶為80～3 000 Hz，增益2 000，疊加200次，以Ⅳ波剛出現(xiàn)時(shí)的刺激強(qiáng)度PESPL值為腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位反應(yīng)閾值。

1.8 取材

移植后1、3、6和12個(gè)月每組隨機(jī)抽取10只大鼠，戊巴比妥納深度麻醉后開(kāi)胸，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，快速灌注生理鹽水150 ml，后用4%多聚甲醛灌注固定，取耳蝸，后固定24 h用于冰凍切片。取材后處理：將耳蝸組織取出移入30%蔗糖溶液中，4 ℃浸泡24 h以上，直至耳蝸組織沉底。將耳蝸組織用OCT包埋劑包埋后-20℃下保存?zhèn)溆谩Ｖ肙CT包埋耳蝸組織于冰凍切片機(jī)載物臺(tái)上，行冰凍切片，片厚30 μm，切片置于PBS中漂洗。

1.9 免疫熒光染色

Nestin免疫熒光染色鑒定耳蝸干細(xì)胞，Brdu免疫熒光染色檢測(cè)具有增殖特性的耳蝸干細(xì)胞的細(xì)胞核，Myosin Ⅶ A免疫熒光染色檢測(cè)早期分化的毛細(xì)胞，熒光顯微鏡觀(guān)察并攝片。顯微鏡下觀(guān)察5個(gè)視野取平均值，計(jì)數(shù)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞、耳蝸干細(xì)胞、毛細(xì)胞的數(shù)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均值的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 E14大鼠耳蝸干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

剛分離的單細(xì)胞鏡下呈圓形，大小不一，無(wú)突起長(zhǎng)出。5～6 d后可見(jiàn)大量懸浮的細(xì)胞團(tuán)形成，原代的細(xì)胞球經(jīng)胰酶消化后繼續(xù)傳代培養(yǎng)又可形成新的細(xì)胞球(圖1、2)。這些細(xì)胞球經(jīng)Nestin免疫熒光鑒定呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明是具有自我更新能力的干細(xì)胞。

2.2 聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位檢測(cè)

術(shù)后1、3、6和12個(gè)月各組模型大鼠聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位結(jié)果顯示，與耳蝸干細(xì)胞移植組相比，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位閾值較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，腦干誘發(fā)電位闕值均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。表1 各組術(shù)后聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位閾值比較

2.3 免疫熒光檢測(cè)

2.3.1 Nestin免疫熒光檢測(cè) Nestin免疫熒光鑒定檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞球，證明實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的細(xì)胞是耳蝸干細(xì)胞(圖3)。熒光顯微鏡下Brdu標(biāo)記細(xì)胞呈綠色單核細(xì)胞，說(shuō)明培養(yǎng)的是具有增殖特性的干細(xì)胞(圖4)。耳蝸干細(xì)胞移植組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組耳蝸標(biāo)本移植后1個(gè)月和3個(gè)月沿移植針道分布大量綠色熒光信號(hào)，集中在鼓階，前庭階和膜蝸管少。切片中還可見(jiàn)呈散點(diǎn)狀分布的綠色熒光信號(hào)。綠色熒光顯示的是Nestin(+)的耳蝸干細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形，體積大小不等，在局部區(qū)域還可見(jiàn)兩三個(gè)細(xì)胞聚集在一起形成的細(xì)胞團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞可從神經(jīng)球體中遷移出來(lái)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則(圖5)。空白對(duì)照組切片中可見(jiàn)強(qiáng)度微弱的散在熒光。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組的Nestin(+)細(xì)胞數(shù)量較耳蝸干細(xì)胞移植組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。耳蝸干細(xì)胞移植組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組移植后6個(gè)月和12個(gè)月Nestin免疫熒光鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)沿移植針道分布微弱的綠色熒光信號(hào)，但數(shù)量較移植1個(gè)月和3個(gè)月的少，而且距離移植針道位置稍遠(yuǎn)。

2.3.2 Myosin Ⅶ A免疫熒光檢測(cè) 感音神經(jīng)性耳聾模型大鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞排列欠整齊，出現(xiàn)毛細(xì)胞排列稀疏倒伏等情況(圖6)。耳蝸干細(xì)胞移植組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組移植后6個(gè)月和12個(gè)月Myosin Ⅶ A免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，沿移植針道周?chē)植技t色熒光信號(hào);Brdu免疫熒光鑒定切片中仍可見(jiàn)呈散點(diǎn)狀分布的綠色熒光信號(hào)，但較弱;在距離移植針道位置稍遠(yuǎn)處，Myosin Ⅶ A(+)細(xì)胞呈現(xiàn)良好的分布，有向基底膜和柯蒂氏器遷移行為，陽(yáng)性細(xì)胞突起較短，生長(zhǎng)狀況較好。也有的細(xì)胞位置不確定，但是從遷移的細(xì)胞數(shù)量上來(lái)看，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組的Myosin Ⅶ A(+)細(xì)胞數(shù)量較耳蝸干細(xì)胞移植組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。對(duì)照組移植針道周?chē)瘦^弱的熒光信號(hào)。表2 Nestin(+)細(xì)胞和Myosin ⅦA(+)細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)個(gè)

3 討 論

噪聲、抗生素和激光等人為刺激可致在體和離體組織塊內(nèi)耳毛細(xì)胞創(chuàng)傷，因?yàn)槊?xì)胞的壞死變性是不可逆的，所以耳聾疾病在臨床上幾乎沒(méi)有治愈的可能。對(duì)毛細(xì)胞的再生和功能重建研究，是近年來(lái)聽(tīng)力學(xué)研究的熱門(mén)課題[6-8]。

胚胎干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使人們想到如果把這種細(xì)胞移植入相應(yīng)的動(dòng)物模型體內(nèi)，修補(bǔ)或替代壞死的組織細(xì)胞，就可以達(dá)到治療臨床疾病的目的。自我更新和高度增殖的特性將有可能使衰老的肌肉、病態(tài)的心臟和遲鈍的大腦重新恢復(fù)健康。目前人類(lèi)干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已成為生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中最有希望和最有吸引力的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，基因治療和干細(xì)胞移植治療已成為各類(lèi)疾病的主要治療手段[9-11]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞移植入內(nèi)耳耳蝸后，在移植組織內(nèi)有向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)[12-14]。因此，干細(xì)胞內(nèi)耳移植后分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞可能是毛細(xì)胞再生的方法。我們?cè)跓o(wú)菌條件下對(duì)內(nèi)耳進(jìn)行取材，取出耳蝸后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)后的細(xì)胞經(jīng)Nestin免疫熒光鑒定呈陽(yáng)性反應(yīng)，Brdu鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞是具有增殖潛能的耳蝸干細(xì)胞的細(xì)胞核。感音神經(jīng)性耳聾大鼠模型制作成功后，將培養(yǎng)的耳蝸干細(xì)胞移植到模型大鼠內(nèi)耳鼓階，術(shù)后1、3、6和12個(gè)月各組模型大鼠聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位測(cè)定結(jié)果顯示，耳蝸干細(xì)胞移植組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組感音神經(jīng)性耳聾模型大鼠的聽(tīng)力功能隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)有所改善，尤其是當(dāng)歸補(bǔ)血湯組大鼠的聽(tīng)力恢復(fù)更佳。說(shuō)明移植到大鼠內(nèi)耳的耳蝸干細(xì)胞不但可以存活，而且會(huì)隨著時(shí)間的推移逐漸分化為內(nèi)耳功能細(xì)胞即毛細(xì)胞，并且這種毛細(xì)胞會(huì)逐漸向損傷區(qū)域遷移，替代壞死的毛細(xì)胞，使大鼠的聽(tīng)力功能得到恢復(fù)。但這種功能恢復(fù)是否會(huì)持久，完全取決于移植分化的毛細(xì)胞是否在宿主體內(nèi)能夠長(zhǎng)期存活并遷移至損傷部位，與聽(tīng)神經(jīng)元建立突觸連接，以上問(wèn)題還需要長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察，也將是我們下一步的研究方向。

移植后1個(gè)月和3個(gè)月耳蝸標(biāo)本免疫熒光染色結(jié)果顯示，耳蝸干細(xì)胞移植組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組沿移植針道分布大量綠色熒光信號(hào)，細(xì)胞呈圓形，體積大小不等，在局部區(qū)域還可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞可從細(xì)胞球中遷移出來(lái)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，集中在鼓階，前庭階和膜蝸管少。綠色熒光是Nestin(+)的耳蝸干細(xì)胞，說(shuō)明我們移植的的確是耳蝸干細(xì)胞，而且細(xì)胞形態(tài)也符合干細(xì)胞的特性。隨著時(shí)間的推移，耳蝸干細(xì)胞有向神經(jīng)球外遷移的跡象，而且在移植環(huán)境刺激因素的作用下可能分化為其它細(xì)胞。這進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)驗(yàn)移植的的確是耳蝸干細(xì)胞，而且耳蝸干細(xì)胞會(huì)在宿主體內(nèi)存活，但位置仍大多分布在針道周?chē)瑐€(gè)別細(xì)胞發(fā)生遷移，但遷移速度較慢。而移植后6個(gè)月和12個(gè)月耳蝸標(biāo)本Nestin免疫熒光鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沿移植針道分布微弱的綠色熒光信號(hào)，說(shuō)明耳蝸干細(xì)胞在移植宿主體內(nèi)隨著時(shí)間的推移會(huì)發(fā)生分化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Myosin ⅦA(+)細(xì)胞呈現(xiàn)良好的分布，有向基底膜和柯蒂氏器遷移行為，生長(zhǎng)狀況較好，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，移植的耳蝸干細(xì)胞會(huì)分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞，分化的毛細(xì)胞會(huì)繼續(xù)發(fā)生遷移，遷移至離針道較遠(yuǎn)區(qū)域。Brdu免疫熒光鑒定顯示切片中仍可見(jiàn)呈散點(diǎn)狀分布的綠色熒光信號(hào)，但數(shù)量較移植后1個(gè)月和3個(gè)月的少，而且距離移植針道位置稍遠(yuǎn)。這說(shuō)明Brdu在移植宿主體內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)發(fā)生衰減，在分化的細(xì)胞中Brdu含量較少。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯是臨床內(nèi)科應(yīng)用最廣泛的中藥之一，用于心腦血管疾病和血液系統(tǒng)疾病的治療[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與耳蝸干細(xì)胞移植組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組移植后1個(gè)月和3個(gè)月Nestin(+)細(xì)胞數(shù)量增多，移植后6個(gè)月和12個(gè)月Myosin ⅦA(+)細(xì)胞數(shù)量也增多，說(shuō)明當(dāng)歸補(bǔ)血湯還可以促進(jìn)移植的耳蝸干細(xì)胞在移植組織內(nèi)的存活和分化，提高移植的耳蝸干細(xì)胞向功能細(xì)胞的分化比例。

研究表明多種營(yíng)養(yǎng)因子在聽(tīng)覺(jué)功能細(xì)胞的發(fā)育、存活和生理功能維持中起到重要作用[17-19]。我們推測(cè)一方面當(dāng)歸補(bǔ)血湯中除神經(jīng)鞘磷酯、神經(jīng)節(jié)苷酯、神經(jīng)酰胺等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，可能還含有多種營(yíng)養(yǎng)因子，使移植的耳蝸干細(xì)胞向早期毛細(xì)胞分化數(shù)量增多，提高了向功能細(xì)胞分化的比例。另外一方面移植實(shí)驗(yàn)中組織的處理、動(dòng)物麻醉、機(jī)械損傷或胰酶消化、缺血缺氧、局部損傷、血供缺乏等會(huì)造成移植宿主組織局部缺血缺氧，當(dāng)歸注射液減弱了缺氧刺激引起的神經(jīng)干細(xì)胞的壞死和凋亡，提示當(dāng)歸對(duì)缺氧可能有保護(hù)作用。拆方研究表明，當(dāng)歸或黃芪能在組織細(xì)胞缺血缺氧時(shí)擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，因而推測(cè)其也可能通過(guò)直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和自由基反應(yīng)等多種機(jī)制拮抗自由基對(duì)組織的損害，從而使移植的耳蝸干細(xì)胞向早期毛細(xì)胞分化數(shù)量增多。另外移植后宿主局部組織的排斥反應(yīng)會(huì)比較強(qiáng)烈，有研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞增殖率，黃芪黃酮、黃芪皂苷以及黃芪和當(dāng)歸的揮發(fā)油均有良好的雙向免疫調(diào)節(jié)作用[20]，所以我們也有理由推測(cè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過(guò)降低耳蝸內(nèi)的移植排斥反應(yīng)而提高移植的耳蝸干細(xì)胞存活，提高毛細(xì)胞的分化比例。其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。