【摘要】 目的用利福平、異煙肼藥物作用 H37Rv 株，誘導(dǎo)基因突變，用基因芯片技術(shù)檢測耐藥菌株突變基因位點。 方法 H37Rv 菌株用不同濃度的利福平和異煙肼加入培養(yǎng)液中觀察菌株的耐藥生長情況，耐藥菌株用 PCR 擴增產(chǎn)物雜交，基因芯片檢測藥物作用部位是否有突變，檢測突變基因位點。 結(jié)果利福平藥物誘導(dǎo)H37Rv耐藥，用基因芯片技術(shù)檢測利福平耐藥菌株，rpoB 基因 531 位發(fā)生突變，TCG 轉(zhuǎn)變?yōu)?TTG，直接測序發(fā)現(xiàn)在相同 位點發(fā)生突變。耐異煙肼耐藥菌株 katG 基因 315 位發(fā)生突變，AGC 轉(zhuǎn)變?yōu)?ACC。同時加入兩種藥物的耐藥株用基因芯片檢測分別在 rpoB 基因 531位，katG 基因 315 位發(fā)生突變。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥的機理與藥物作用基因位點突變有關(guān)。基因芯片檢測技術(shù)耐藥菌株基因突變，不僅可以準確地確定突變位點和突變類型，快速、高效、設(shè)備簡單，并能同時檢測分析成千上萬個基因有關(guān)突變位點。

【關(guān)鍵詞】 H37Rv 株；藥物誘導(dǎo)耐藥；DNA 芯片；突變基因

我國是世界上結(jié)核病發(fā)病率最高的 22 個國家之一，肺結(jié)核患者約有 600 萬人，每年約有 25 萬人死亡。世界衛(wèi)生組織報警：肺結(jié)核日奪全球千人性命，在西太平洋地區(qū)每日有近 1 000 人死于肺結(jié)核，將削弱地區(qū)的經(jīng)濟增長，肺結(jié)核大部分患者年齡在 15 歲至 54 歲之間，是社會的主要勞動力。如果作為家庭經(jīng)濟支柱，經(jīng)濟有重要影響，在孟加拉國每 2 min 就有 1 人感染肺結(jié)核，每 10 min 就有 1 人死于結(jié)核病。結(jié)核病嚴重危害人類健康及經(jīng)濟的發(fā)展。結(jié)核病流行顯示高患病率、高耐藥率、低速降率等特點[1]，特別是抗結(jié)核藥物的廣泛應(yīng)用及不合理的服藥，結(jié)核桿菌產(chǎn)生高耐藥，臨床檢測困難，耐藥菌株存在作為傳染源，對流行病的控制帶來嚴重威脅。快速檢測那部分耐藥菌株，可為臨床診斷治療提供可靠的依據(jù)。為了消除傳染源，控制結(jié)核病的流行，我們用利福平等藥物作用于結(jié)核菌，用基因芯片技術(shù)檢測耐藥菌株的基因變化，有快速高效的應(yīng)用效果，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1材料和儀器

1.1.1全自動血培養(yǎng)儀Esp c lture systemⅡ。

1.1.2結(jié)核菌培養(yǎng)液Esp myco 培養(yǎng)瓶，12.5 mL/ 瓶，美國 TREK Diagnostic systems Inc 生產(chǎn)。

1.1.3生物安全柜Fx1200-Ⅱ-A/B，上海瑞仰凈化設(shè)備有限公司。

1.1.4煮沸箱。

1.1.5Lightcycler 熒光 PCR 儀。

1.1.6Generalscanning 芯片信息系統(tǒng) Scannarray 3000 掃描儀。

1.1.7基因芯片由中科院上海信息系統(tǒng)和微技術(shù)研究所，寧波瑞芯生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.8引物正向 CAG GAC GTG GAG GCG ATC 18 bp；反向 C GCT CAC GTG ACA GAC CG 18 bp；由上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.9 H37Rv 菌株購自中國藥品生物制品檢定所

1.1.10利福平﹑異煙肼醫(yī)院購買。

1.2方法

用利福平﹑異煙肼藥物誘導(dǎo)作用 H37Rv 菌株。

1.2.1H37Rv 菌株在無菌生物柜中打開，用無菌生理鹽水稀釋，抽取 0.5 mL 接種。Esp myco 培養(yǎng)基中置 Esp culture system Ⅱ 培養(yǎng)儀培養(yǎng)，3 周后見細菌生長，繼續(xù)培養(yǎng) 1 周后取培養(yǎng)液 0.5 mL 分別接種于 Esp myco 培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)儀培養(yǎng)，培養(yǎng) 2 周后見各瓶有細菌生長。

1.2.2用利福平加入培養(yǎng)懸液中誘導(dǎo)作用于細菌。利福平 0.15 g/粒，用無菌生理鹽水 10 mL 溶解呈 150 mg/10 mL，抽取 1 mL=15 mg/mL 利福平加 9 mL 生理鹽水，即呈 1.5 mg/mL，即 1 500 g/mL 利福平。

1.2.3取 1 500 g/mL 利福平 2 mL 加入培養(yǎng)液中，濃度呈 240 g/mL 利福平。取 1 500 g/mL 利福平 0.4 mL 加入培養(yǎng)液中，濃度呈 48 g/mL 利福平。取 1 500 g/mL 利福平 0.4 mL 加入培養(yǎng)液中，濃度呈 4.8 g/mL 利福平。依據(jù) WHO 公布的標準：細菌在含 40~50 g/mL 利福平培養(yǎng)基上可以生長為耐藥。

1.2.4用異煙肼加入培養(yǎng)懸液中作用誘導(dǎo)細菌異煙肼 100 mg/ 片，溶于 10 mL 無菌生理鹽水中即 100 mg/10 mL；取 1 mL 加水 9 mL 稀釋濃度呈10 mg/10 mL；取1 mL 加水 9 mL 稀釋濃度呈 1 mg/10 mL，即 1 000 g/10 mL，100 g/mL；取 1 mL 加水 9 mL 稀釋濃度呈 10 g/mL；取 1.4 mL 10 g/mL 利福平加入培養(yǎng)基菌液中呈 1 g/mL 異煙肼濃度。取 1.4 mL 100 g/mL 利福平加入培養(yǎng)基菌液中呈 10 g/mL 異煙肼濃度。取 0.7 mL 100 g/mL 利福平加入培養(yǎng)基菌液中呈 5 g/mL 異煙肼濃度。耐藥標準 1~10 g 異煙肼在培養(yǎng)基上仍能生長。

1.2.5培養(yǎng)基懸液中分別加入含 5 g/mL 異煙肼，48 g/mL 利福平的培養(yǎng)基懸液；配制成含 10 g/mL 異煙肼，248 g/mL 利福平的培養(yǎng)基懸液作用誘導(dǎo)細菌。

以上 1.2.3，1.2.4，1.2.5 配制含不同藥物的培養(yǎng)基置培養(yǎng)儀培養(yǎng)觀察結(jié)果。

1.2.6培養(yǎng)物含不同藥物濃度經(jīng) 70 d 后仍能生長的細菌培養(yǎng)液。分別取耐 48 g/mL 利福平﹑5 g/mL 異煙肼﹑48 g/mL 利福平和 5 g/mL 異煙肼菌液作測定。據(jù)有關(guān)文獻報道，異煙肼耐藥標準 1 g/mL 和 10 g/mL 分別為低濃度和高濃度耐藥[2]，WHO 公布的標準細菌在含 40~50 g/mL 利福平培養(yǎng)基上可以生長判定為耐藥。H37Rv 原菌培養(yǎng)液作對照。用煮沸裂解法提取 DNA，將抽提液用聚合酶鏈反應(yīng)擴增所需目的 DNA 片段。引物由上海生工生物工程服務(wù)公司合成，rpoB 基因引物：上游引物 5＇-CAG GAC GTG GAG GCG ATC-3＇下游引物：5＇-C GCT CAC GTG ACA GAC CG-3＇，序列號 515684，rpoB 基因 794-1974，目前國際國內(nèi)研究突變基因相關(guān)區(qū)域。katG 基因引物 1.5＇-CAC TTT CGG TAA GAC CCA TGG C-3＇，2.5＇-TAT TGC CAA GCG CCA GCA GG-3＇。rpoB 基因，聚合酶鏈反應(yīng)程序，擴增體系 25 L，取制備好的 DNA 樣品 2 L，PCR 反應(yīng)液 Buffer 3 L，dntp 2.5 mmol/L 2 L，Taq 聚合酶 2 L，Mg2+ 2.5 mmol/L 2 L，10pmmol/mL，引物 1、2 各 0.75 L。加水 12.5 L。聚合酶鏈反應(yīng)程序：首先將標本預(yù)變性 94℃ 4 min，再以 94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s 循環(huán) 35 次。再后 72℃ 延伸 4 min，置 2~8℃ 保存。KatG 反應(yīng)體系：50 L。Buffer 5 L；2 mmol/L MgCl 4 L；dntp 5 L；引物 1 20 mol/L 1 L；引物 2 20 mol/L 1 L；Tap 聚合酶 5 g/l 0.4 L；模板 5 L；H2O 28.6 L。反應(yīng)程序：首先 94℃ 3 min 預(yù)變性，然后以 94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環(huán)，再后以 72℃ 5 min 延伸，置 2~8℃ 保存。

1.2.7聚合酶鏈擴增產(chǎn)物由中科院上海信息系統(tǒng)和微技術(shù)研究所寧波瑞芯生物制品有限公司用基因芯片技術(shù)進行基因測序及基因突變分析。 H37Rv 對照樣本及耐藥菌株的擴增產(chǎn)物，用基因芯片序列測定。該芯片包括：511，513，514，516，526，531，532 和 533 位密碼子突變在內(nèi)的 30 種單核苷酸變態(tài)性。還包括 katG 基因 282~387 位密碼子。

2實驗結(jié)果

2.1培養(yǎng)結(jié)果觀察

含異煙肼 5 g/mL 培養(yǎng)基在 35 d，70 d 仍見細 菌生長。含利福平 48 g/mL 培養(yǎng)基在 21 d，35 d，70 d 仍見細菌生長。含利福平 48 g/mL 和異煙肼 5 g/mL 培養(yǎng)基在 21 d，35 d，70 d 仍見細菌生長。

2.2基因芯片檢測結(jié)果

2.2.1H37Rv 株基因芯片測序及直接測序為野生型。

2.2.2H37Rv 利福平耐藥株基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)531 位基因發(fā)生突變。TCG 突變?yōu)?TTG。

2.2.3利福平加異煙肼作用 H37Rv 株耐藥發(fā)現(xiàn)531 位、315 位均發(fā)生突變。TCG 突變?yōu)?TTG AGC 突變?yōu)?ACC。

2.3直接測序結(jié)果

2.3.1H37Rv 株用測序儀直接測序未見突變基因。

2.3.2利福平作用 H37Rv 株見 531 位發(fā)生突變。TCG 突變?yōu)?TTG。

2.3.3異煙肼作用 H37Rv 株見 315 位發(fā)生突變。AGC 突變?yōu)?ACC。

3討論

抗結(jié)核藥物的誕生拯救了無數(shù)結(jié)核病患者的生命，對結(jié)核流行病的控制發(fā)揮了巨大作用。但隨著藥物的濫用及不正規(guī)使用，結(jié)核菌應(yīng)對環(huán)境的生存條件，對一些藥物產(chǎn)生耐藥，無論細胞膜或細胞核都會發(fā)生變異。菌株能變異成顆粒狀，抗酸性陰性或減弱。研究發(fā)現(xiàn) DNA 發(fā)生突變，是藥物作用部位的遺傳基因發(fā)生改變而產(chǎn)生耐藥。實驗用利福平誘導(dǎo) H37Rv 株發(fā)現(xiàn) DNA531 位堿基發(fā)生突變：TCG→TTG，產(chǎn)生耐藥，且仍具生命。利福平藥物的作用是通過細菌 DNA 聚合酶β亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起始和 RNA 的延伸，起到殺菌作用。這個結(jié)合位點是由不同 RNA 聚合酶亞單位上關(guān)鍵氨基酸的改變而導(dǎo)致其構(gòu)象的改變，從而使藥物結(jié)合位點缺失[3]。 rpoB 基因是細菌 RNA 聚合酶β亞基的編碼基因，全長 3 543 個堿基，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)其中長 81 個堿基的核心區(qū)易發(fā)生突變，利福平不能與 RNA 聚合酶亞基結(jié)合因而細菌產(chǎn)生耐藥，這與 Garoial 等的結(jié)果相似[4]。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn) 531 位發(fā)生突變與國外報道相符。

目前國內(nèi)外研究證明 90%~95% 的結(jié)核分枝桿菌耐利福平菌株存在 rPOB 基因突變，而且這些突變集中于核心區(qū)域內(nèi)包括 507~533 位是耐利福平的決定區(qū)。

異煙肼作用 H37Rv 株誘導(dǎo)結(jié)果發(fā)現(xiàn) DNA315 位堿基發(fā)生突變。近年來國內(nèi)外學(xué)者的大量研究認為異煙肼實際上是一藥物前體，需經(jīng) mtb 過氧化氫- 過氧化酶（katG）活化后才發(fā)揮抗結(jié)核作用，而過氧化氫-過氧化酶正是由 katG 基因編碼的[5]。在對耐INH 的臨床分離株中，3 株菌種有 2 株存在 katG 基因片段的缺失，他們認為 katG 基因的缺失是 mtb，INH 耐藥的共同機理[6]。國內(nèi)吳雪瓊、胡忠義等研究證明 katG 基因突變在 315 位密碼子。目前，我國對 katG 基因的分析多集中于 282 bp 與 237 bp 突變區(qū)域，這些區(qū)域的變異可在 2/3 的耐藥菌株中觀察到[7]。實驗結(jié)果也顯示耐 INH H37Rv 株在 315 位密碼子有突變：AGC 突變?yōu)?ACC（絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸）。katG 基因的突變，過氧化酶活性下降，異煙肼失去對細菌的殺滅作用。

我們用利福平和異煙肼兩種藥物作用 H37Rv 株培養(yǎng)誘導(dǎo)，菌株對兩種藥物均產(chǎn)生耐藥，用基因芯片測序，在 531 位和 315 位堿基均發(fā)生突變：TCG 突變?yōu)?TTG，AGC 突變?yōu)?ACC。這在國內(nèi)外學(xué)者研究中也曾報道：結(jié)核分枝桿菌對多種藥物耐藥。這給臨床治療帶來了困難，提示臨床選用其他的藥物治療。

從我們的實驗中證明了國內(nèi)外學(xué)者對結(jié)核分枝桿菌耐利福平、異煙肼藥物產(chǎn)生，rpoB 基因及 katG 基因突變的研究成果。結(jié)核分枝桿菌 rpoB 基因及katG 基因的改變因而產(chǎn)生對利福平及異煙肼耐藥。

基因芯片技術(shù)在 90 年代首先由美國 Affymetrix 公司的 Fodor 博士提出并開始基因芯片技術(shù)的研究，它是目前分子生物學(xué)最前沿的方法，是物理學(xué)、微電子學(xué)和生命科學(xué)的交叉綜合的高新技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的進行大規(guī)模遺傳變態(tài)性檢測的新方法。基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定中的應(yīng)用，具有高速高效等優(yōu)點，能同時分析成千上萬個基因，用基因芯片直接測序可在幾小時內(nèi)測得結(jié)果。在結(jié)核分枝桿菌耐藥性研究中用芯片檢測結(jié)果突變型，測序結(jié)果也是突變型，而且病人痰液中存在少量的 DNA 就能夠進行結(jié)核分枝桿菌分子的突變，不僅可以正確地確定突變位點和突變類型，而且基因芯片技術(shù)能將大量探針同時固定在支持物上，可以一次性對樣品序列進行檢測和分析。所以可以利用芯片測序的技術(shù)來檢測患者標本中是否存在結(jié)核分枝桿菌，更重要的是它的快速、高效、設(shè)備簡單。既提高了檢測的特異性，又能將結(jié)核桿菌感染和其他分枝桿菌感染區(qū)分。因此，基因芯片技術(shù)可作為臨床檢測結(jié)核桿菌感染。何敏等檢測 102 例肺結(jié)核患者晨痰標本的結(jié)果用基因芯片技術(shù)檢測的陽性率要高于痰涂片法和痰培養(yǎng)法[8]。這一新技術(shù)在臨床推廣應(yīng)用具有極大價值，芯片技術(shù)創(chuàng)始于 20 世紀 90 年代初，是目前分子生物學(xué)最前沿的方法[9]。我們利用基因芯片技術(shù)對 H37Rv 株用藥物作用誘導(dǎo)檢測基因突變，還未在臨床廣泛應(yīng)用。下一步工作將用此技術(shù)應(yīng)用于臨床，為臨床診斷治療提供新的方法。

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