【摘要】 目的 探討考馬斯亮藍(lán)法用于測(cè)定動(dòng)物藥材中可溶性蛋白質(zhì)含量的穩(wěn)定性研究。方法 采用紫外分光光度法，以蟾蜍干體為原料，牛血清白蛋白為對(duì)照，在595 nm處測(cè)定蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合復(fù)合物的吸光值。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)表明，吸光度和蛋白含量間具有良好的線性關(guān)系(r=0.996)，樣品在10 min內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定(RSD=5.0%)。結(jié)論 本方法可靠、簡(jiǎn)單、快速。

【關(guān)鍵詞】 考馬斯亮藍(lán)；動(dòng)物藥材；可溶性蛋白質(zhì)；含量測(cè)定

Abstract: Objective To study the stability of the Bradford method for determination of soluble protein in animal materials. Method The absorption of CBB G-250 combined with proteins was determined by the UV-Spectrophotometry method with the detection wavelength at 595 nm， and the dried bufo was selected as sample， BSA as control. Results The method showed a good linear relationship between absorption and protein content (r=0.996). The sample was stable with in 10 min (RSD=5.0%). Conclusion This method was reliable， simple and rapid.

Key words：CBB；Animal material；soluble protein；content measuring 考馬斯亮藍(lán)法是Bradford 1976年建立起來(lái)的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法，這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。此方法的原理是基于：考馬斯亮藍(lán)G-250是一種蛋白質(zhì)染料，最大吸收峰在465 nm，在酸性溶液中它與蛋白質(zhì)通過(guò)范德瓦爾引力結(jié)合形成考馬斯亮藍(lán)G-250-蛋白質(zhì)復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰改變?yōu)?95 nm，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用此方法初步建立了動(dòng)物藥材可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，從而進(jìn)行了如下相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 牛血清白蛋白(BSA)：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Genview分裝考馬斯亮藍(lán)G-250：Ultra pure上海生物工程有限公司；鹽酸：分析純，北京世紀(jì)紅星化工有限責(zé)任公司；無(wú)水乙醇：分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；0.9%鹽水，同領(lǐng)(大同)藥業(yè)有限公司；UV-2401 PC，SHIMADZU；GL-88B漩渦混合器，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 溶液的配制 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液配制：稱取20 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于20 mL 95%的乙醇中，另取36%鹽酸3 mL和113 mL鹽水混勻，再與考馬斯亮藍(lán)乙醇液混合并定容至200 mL，用前0.45 μm過(guò)濾。1 mg/mL BSA溶液配制：稱取10 mg BSA凍干粉溶于蒸餾水中并定容至10 mL。

1.3 BSA與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后溶液光吸收值的穩(wěn)定性

分別取100 μL BSA含量為314.75 μg/mL、630 ng/mL、2.5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入3 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，于595 nm分別在5、10、20 min 測(cè)定。

1.4 BSA線性關(guān)系考察 取BSA標(biāo)準(zhǔn)630、315、157、79、40、20、10、5、2.5 ng/mL各100 μL加入3 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中，渦旋混勻，分別于5、30 min在595 nm處測(cè)定。

1.5 動(dòng)物藥材水提液可溶性蛋白質(zhì)線性關(guān)系考察

1.5.1 動(dòng)物藥材可溶性蛋白質(zhì)提取液的制備

將蟾蜍干藥材粉碎，過(guò)80目篩，取40 g用80 mL蒸餾水潤(rùn)濕并攪勻，于4 ℃冰箱靜置48 h，4 ℃、9 000 r/min離心40 min，取上清，0.45 μm過(guò)濾即得原液。

1.5.2 動(dòng)物藥材水提液可溶性蛋白質(zhì)線性關(guān)系

將原液用蒸餾水10倍稀釋，并將稀釋液依次10倍稀釋，各取100 μL加入3 mL CBB液中，渦旋混勻，595 nm測(cè)定，得到樣品最低定量限，并初步確定待測(cè)的濃度范圍。將所需的濃度樣品做倍比稀釋，最高濃度標(biāo)記為64，依次稀釋為32、16、8、4、2、1，各取100 μL加入3 mL CBB液中，渦旋混勻，595 nm測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 BSA與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后溶液吸光值穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

(見(jiàn)表1)表1 BSA與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后溶液吸光值穩(wěn)定性研究（略）注：表中每個(gè)光密度值是3次試驗(yàn)的平均值。

由表1可看出：溶液光密度值隨著時(shí)間變化而變化，濃度較高時(shí)呈負(fù)吸收，復(fù)合物吸光值在10 min內(nèi)RSD較小，溶液較穩(wěn)定，濃度太高或太低穩(wěn)定性都較差，所以尋找適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度，并且在10 min內(nèi)測(cè)定很重要。 2.2 BSA濃度對(duì)吸光度的線性關(guān)系

5 min時(shí)在400～800 nm對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白復(fù)合物全波長(zhǎng)掃描，當(dāng)濃度為5.0 ng/mL的S/N=3，5.0 ng/mL可作為最低檢測(cè)限，實(shí)驗(yàn)表明：40 ng/mL作為最低定量限，由圖1可看出5～40 μg/mL不呈線性，在40～630 ng/mL線性較好，說(shuō)明蛋白質(zhì)濃度較低時(shí)有線性關(guān)系，但濃度太低時(shí)不存在線性。

5 min時(shí)測(cè)得的R=0.996，在30 min時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白復(fù)合物線性關(guān)系時(shí)R=0.941，由相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可知，復(fù)合物隨著時(shí)間變化線性關(guān)系變差(見(jiàn)圖2、圖3)。 2.3 動(dòng)物藥材粗提液可溶性蛋白質(zhì)的線性關(guān)系

試驗(yàn)過(guò)程中在原液108稀釋時(shí)得到復(fù)合物最低檢測(cè)限，將 106倍稀釋液作為基礎(chǔ)倍比稀釋，在10 min內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系較好(見(jiàn)圖4)。

3 討論 雖然Bradford法有不少優(yōu)點(diǎn)，但由于受到影響的因素較多，優(yōu)化出一套較好的實(shí)驗(yàn)條件并不容易。Marcelo等[1]對(duì)此法的機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，認(rèn)為pH值、時(shí)間、溫度是本方法的重要變量。由于溫度的影響具體操作有困難，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)溫度進(jìn)行研究。對(duì)時(shí)間的考察本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為在復(fù)合物形成后的10 min內(nèi)測(cè)定比較好。 實(shí)驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白與樣品均用蒸餾水溶解，已有研究證明不同溶劑光吸收的差異對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果無(wú)影響[2]。而且本實(shí)驗(yàn)蛋白溶液和考馬斯亮藍(lán)溶液體積比為1∶30，溶劑對(duì)光吸收的影響更小。 H+濃度是影響標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系的主要因素，適當(dāng)控制顯色液中的H+濃度使顯色前后H+濃度保持恒定非常重要。有文獻(xiàn)用磷酸配緩沖液，但酸濃度不好控制，酸濃度降低靈敏度增大，但酸濃度低到一定程度后靈敏度下降，線性關(guān)系隨酸濃度的降低明顯的變差，酸濃度高線性關(guān)系較好但靈敏度低，增加蛋白濃度易出現(xiàn)復(fù)合物沉淀。本實(shí)驗(yàn)采用了郭氏提供的顯色液配方[3]，即使用的HCl-NaCl緩沖液溶解考馬斯亮藍(lán)G-250，而且線性關(guān)系的確不錯(cuò)。

【參考文獻(xiàn)】 [1] MAO Silva， MAZ Arruda. Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric determination of total proteins. Anal[J].Biochem，2006，(351)：155－157. [2] 曲春香，沈頌東，王雪峰.用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定植物粗提液中可溶性蛋白質(zhì)含量方法的研究[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，22(6)：82－85. [3] 郭敏亮，姜永明.考馬斯亮藍(lán)線色液組分對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23(6)：558－561.