【摘要】 目的 探討考馬斯亮藍(lán)法用于測定動物藥材中可溶性蛋白質(zhì)含量的穩(wěn)定性研究。方法 采用紫外分光光度法，以蟾蜍干體為原料，牛血清白蛋白為對照，在595 nm處測定蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合復(fù)合物的吸光值。結(jié)果 實驗表明，吸光度和蛋白含量間具有良好的線性關(guān)系(r=0.996)，樣品在10 min內(nèi)測定穩(wěn)定(RSD=5.0%)。結(jié)論 本方法可靠、簡單、快速。

【關(guān)鍵詞】 考馬斯亮藍(lán)；動物藥材；可溶性蛋白質(zhì)；含量測定

Abstract: Objective To study the stability of the Bradford method for determination of soluble protein in animal materials. Method The absorption of CBB G-250 combined with proteins was determined by the UV-Spectrophotometry method with the detection wavelength at 595 nm， and the dried bufo was selected as sample， BSA as control. Results The method showed a good linear relationship between absorption and protein content (r=0.996). The sample was stable with in 10 min (RSD=5.0%). Conclusion This method was reliable， simple and rapid.

Key words：CBB；Animal material；soluble protein；content measuring 考馬斯亮藍(lán)法是Bradford 1976年建立起來的測定蛋白質(zhì)含量的方法，這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。此方法的原理是基于：考馬斯亮藍(lán)G-250是一種蛋白質(zhì)染料，最大吸收峰在465 nm，在酸性溶液中它與蛋白質(zhì)通過范德瓦爾引力結(jié)合形成考馬斯亮藍(lán)G-250-蛋白質(zhì)復(fù)合物時，其最大吸收峰改變?yōu)?95 nm，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可用于蛋白質(zhì)含量的測定。本實驗室應(yīng)用此方法初步建立了動物藥材可溶性蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)，從而進(jìn)行了如下相關(guān)實驗的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 牛血清白蛋白(BSA)：北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Genview分裝考馬斯亮藍(lán)G-250：Ultra pure上海生物工程有限公司；鹽酸：分析純，北京世紀(jì)紅星化工有限責(zé)任公司；無水乙醇：分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；0.9%鹽水，同領(lǐng)(大同)藥業(yè)有限公司；UV-2401 PC，SHIMADZU；GL-88B漩渦混合器，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 溶液的配制 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液配制：稱取20 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于20 mL 95%的乙醇中，另取36%鹽酸3 mL和113 mL鹽水混勻，再與考馬斯亮藍(lán)乙醇液混合并定容至200 mL，用前0.45 μm過濾。1 mg/mL BSA溶液配制：稱取10 mg BSA凍干粉溶于蒸餾水中并定容至10 mL。

1.3 BSA與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后溶液光吸收值的穩(wěn)定性

分別取100 μL BSA含量為314.75 μg/mL、630 ng/mL、2.5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入3 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，于595 nm分別在5、10、20 min 測定。

1.4 BSA線性關(guān)系考察 取BSA標(biāo)準(zhǔn)630、315、157、79、40、20、10、5、2.5 ng/mL各100 μL加入3 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中，渦旋混勻，分別于5、30 min在595 nm處測定。

1.5 動物藥材水提液可溶性蛋白質(zhì)線性關(guān)系考察

1.5.1 動物藥材可溶性蛋白質(zhì)提取液的制備

將蟾蜍干藥材粉碎，過80目篩，取40 g用80 mL蒸餾水潤濕并攪勻，于4 ℃冰箱靜置48 h，4 ℃、9 000 r/min離心40 min，取上清，0.45 μm過濾即得原液。

1.5.2 動物藥材水提液可溶性蛋白質(zhì)線性關(guān)系

將原液用蒸餾水10倍稀釋，并將稀釋液依次10倍稀釋，各取100 μL加入3 mL CBB液中，渦旋混勻，595 nm測定，得到樣品最低定量限，并初步確定待測的濃度范圍。將所需的濃度樣品做倍比稀釋，最高濃度標(biāo)記為64，依次稀釋為32、16、8、4、2、1，各取100 μL加入3 mL CBB液中，渦旋混勻，595 nm測定。

2 結(jié)果

2.1 BSA與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后溶液吸光值穩(wěn)定性測定結(jié)果

(見表1)表1 BSA與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后溶液吸光值穩(wěn)定性研究（略）注：表中每個光密度值是3次試驗的平均值。

由表1可看出：溶液光密度值隨著時間變化而變化，濃度較高時呈負(fù)吸收，復(fù)合物吸光值在10 min內(nèi)RSD較小，溶液較穩(wěn)定，濃度太高或太低穩(wěn)定性都較差，所以尋找適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度，并且在10 min內(nèi)測定很重要。 2.2 BSA濃度對吸光度的線性關(guān)系

5 min時在400～800 nm對標(biāo)準(zhǔn)蛋白復(fù)合物全波長掃描，當(dāng)濃度為5.0 ng/mL的S/N=3，5.0 ng/mL可作為最低檢測限，實驗表明：40 ng/mL作為最低定量限，由圖1可看出5～40 μg/mL不呈線性，在40～630 ng/mL線性較好，說明蛋白質(zhì)濃度較低時有線性關(guān)系，但濃度太低時不存在線性。

5 min時測得的R=0.996，在30 min時測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白復(fù)合物線性關(guān)系時R=0.941，由相對標(biāo)準(zhǔn)偏差可知，復(fù)合物隨著時間變化線性關(guān)系變差(見圖2、圖3)。 2.3 動物藥材粗提液可溶性蛋白質(zhì)的線性關(guān)系

試驗過程中在原液108稀釋時得到復(fù)合物最低檢測限，將 106倍稀釋液作為基礎(chǔ)倍比稀釋，在10 min內(nèi)測定線性關(guān)系較好(見圖4)。

3 討論 雖然Bradford法有不少優(yōu)點，但由于受到影響的因素較多，優(yōu)化出一套較好的實驗條件并不容易。Marcelo等[1]對此法的機制進(jìn)行了深入的研究，認(rèn)為pH值、時間、溫度是本方法的重要變量。由于溫度的影響具體操作有困難，本實驗未對溫度進(jìn)行研究。對時間的考察本實驗認(rèn)為在復(fù)合物形成后的10 min內(nèi)測定比較好。 實驗中所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白與樣品均用蒸餾水溶解，已有研究證明不同溶劑光吸收的差異對蛋白質(zhì)的測定結(jié)果無影響[2]。而且本實驗蛋白溶液和考馬斯亮藍(lán)溶液體積比為1∶30，溶劑對光吸收的影響更小。 H+濃度是影響標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系的主要因素，適當(dāng)控制顯色液中的H+濃度使顯色前后H+濃度保持恒定非常重要。有文獻(xiàn)用磷酸配緩沖液，但酸濃度不好控制，酸濃度降低靈敏度增大，但酸濃度低到一定程度后靈敏度下降，線性關(guān)系隨酸濃度的降低明顯的變差，酸濃度高線性關(guān)系較好但靈敏度低，增加蛋白濃度易出現(xiàn)復(fù)合物沉淀。本實驗采用了郭氏提供的顯色液配方[3]，即使用的HCl-NaCl緩沖液溶解考馬斯亮藍(lán)G-250，而且線性關(guān)系的確不錯。

【參考文獻(xiàn)】 [1] MAO Silva， MAZ Arruda. Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric determination of total proteins. Anal[J].Biochem，2006，(351)：155－157. [2] 曲春香，沈頌東，王雪峰.用考馬斯亮藍(lán)測定植物粗提液中可溶性蛋白質(zhì)含量方法的研究[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，22(6)：82－85. [3] 郭敏亮，姜永明.考馬斯亮藍(lán)線色液組分對蛋白質(zhì)測定的影響[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23(6)：558－561.