作者：趙國定， 高克加， 田英敏， 葉智衛， 李偉， 宋海萍， 蔡征宇

【摘要】 目的：探討自制煎方骨康靈聯合非放射性同位素藥物锝99亞甲基二膦酸鈉（technetium ［99Tc］ methylene diphosphonate injection， 99TcMDP）治療骨質疏松癥的優越性。方法：肌肉注射鹽酸地塞米松針劑（dexamethasone， DX）制作兔骨質疏松模型，將實驗兔分為8組：A、B組為正常對照組；C、D組為骨質疏松對照組；E組為99TcMDP治療組；F組為氨基二膦酸鹽治療組；G組為單用骨康靈治療組；H組為99TcMDP聯合骨康靈治療組。A、C組實驗兔于實驗第8周處死，以證實骨質疏松模型成立。E、F、G、H組實驗兔于治療16周后與B、D組一起處死，行病理細胞學分析、骨形態計量分析、骨密度檢測、生物力學試驗、X線攝片、CT攝片、核素骨骼掃描以及血清骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase， BALP）和骨鈣素（骨谷氨酸蛋白）（bone gla protein， BGP）的測定。結果：實驗兔連續肌肉注射DX 8周后，A組實驗兔骨小梁排列規則，呈正常骨組織形態。C組實驗兔骨小梁排列稀疏，存在較明顯的骨小梁斷裂現象，呈骨組織破壞形態，同時A、C兩組在骨密度、骨生物力學、骨形態計量等方面的差異，均有統計學意義。實驗室檢查結果顯示，兔骨質疏松動物模型成立。實驗第9周對E組、F組、G組、H組實驗兔進行治療。細胞病理切片顯示，D組實驗兔骨小梁明顯稀疏，有斷裂和缺損區或凹陷。B組骨小梁排列均勻、規則，H、E組的細胞學表現為在骨質疏松的基礎上骨質和骨小梁明顯得到了修復，骨小梁增粗，F組實驗兔的細胞學表現則優于G組，G組又略優于D組，H、E組更明顯優于D組。結論：骨康靈與具有高親骨特異性調節骨代謝作用的同位素藥物99TcMDP聯合治療兔實驗性骨質疏松的效果明顯優于單獨治療。

【關鍵詞】 骨質疏松; 99m锝美羅酸鹽; 治療; 兔

Objective: To evaluate the advantage of Gukangling Decoction (GKLD)， a compound traditional Chinese herbal medicine， combined with technetium ［99Tc］ methylene diphosphonate injection (99TcMDP) in treating osteoporosis in rabbits.

Methods: A rabbit model of osteoporosis was established by intramuscular injection of dexamethasone (DX). Fiftysix rabbits were pided into 8 groups: Group A， B， C， D， E， F， G and H. Rabbits in groups A and B were intramuscularly injected normal saline as normal control， groups C and D were untreated groups， rabbits in group E were treated by 99TcMDP， rabbits in group F were treated by aminodiphosphate， rabbits in group G were treated by GKLD， and rabbits in group H were treated by 99TcMDP and GKLD. Rabbits in groups A and C were executed to demonstrate the establishment of the rabbit model of osteoporosis at the 8th week of experiment. Rabbits in the other six groups were executed after 16week experiment (8week treatment)， and then bone structure and cell shape were observed by electron microscope， Xray， CT and emission computed tomography (ECT). Bone density， biomechanical parameters， the levels of bone specific alkaline phosphatase (BALP) and bone Gla protein (BGP) were measured too.

Results: After 8week of intramuscular injection of DX， the bone trabecula in group A were regular and showed normal configuration， while the bone trabecula in group C were sparse， ruptured and showed damaged form. The bone density and biomechanical parameters in group A were higher than those in group C， indicating that the rabbit model of osteoporosis was established successfully. At the 9th week of experiment， the results of cell pathology in group D showed that the bone trabeculas were sparse， ruptured， defected or had hollow section， but the bone trabeculas in group B were regular and dense. The bone trabeculas in groups H and E were restored， and were thicker than those in group D. The bone quality in groups H and E was better than group D significantly， the bone quality in group F was better than group G， and the bone quality in group G was better than group D slightly.

Conclusion: GKLD combined with 99TcMDP had superiority in treating osteoporosis of rabbits as compared with the respective single therapy.

Keywords: osteoporosis; technetium Tc 99m medronate; therapy; rabbits

骨質疏松癥是中、老年人較普遍存在的疾病［1，2］，在老齡化的城市里尤為突出。我科采用锝99亞甲基二膦酸鈉（technetium ［99Tc］ methylene diphosphonate injection， 99TcMDP）聯合我院自配中藥處方骨康靈治療骨質疏松動物模型，并與各藥物（氨基二膦酸鹽、99TcMDP和骨康靈）單獨治療進行了療效比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 制作骨質疏松動物模型的實驗兔由上海生旺實驗動物養殖有限公司提供；動物實驗場所為上海交通大學第六人民醫院動物實驗室。

1.2 藥物及試劑 同位素藥物99TcMDP由成都云克藥業責任有限公司提供，其中，A瓶為99Tc液，5 ml/瓶，1.1 μg/ml，B瓶為MDP，5 mg/瓶；鹽酸地塞米松針劑（dexamethasone， DX）1 ml/支，5 mg/ml，由上海信誼藥廠生產；氨基二膦酸鹽（阿侖膦酸鈉）由默沙東（意大利）公司美國默克公司分部提供，10 mg/片；上海市黃埔區中心醫院中醫內科經長期研究自制煎方骨康靈，由黃芪、熟地黃、骨碎補、仙靈脾、鹿角片、炙龜板、紅花、參三七、全蝎等藥組成。

1.3 實驗室檢測 骨密度、骨形態計量分析和生物力學試驗由復旦大學醫學院骨代謝實驗室協助檢測；骨細胞學分析、X線、CT攝片、核素骨骼掃描、兔血清骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase， BALP）以及骨鈣素（骨谷氨酸蛋白）（bone Gla protein， BGP）采用國產生化儀、放射免疫γ檢測儀和國產試劑檢測，在上海市黃浦區中心醫院進行。

1.4 動物分組及處理 健康新西蘭實驗兔56只，平均體質量（3.00±0.16）kg。將實驗兔分為8組：A、B組為正常對照組；C、D組為骨質疏松對照組；E組為99TcMDP治療組；F組為氨基二膦酸鹽治療組；G組為骨康靈治療組；H組為骨康靈聯合同位素99TcMDP治療組，每組各7只。所有藥物治療組均在骨質疏松模型基礎上進行治療。A、C組實驗兔在實驗第8周處死，以證實骨質疏松模型成立。E、F、G、H組于治療16周后與B、D組一起處死。

1.5 動物模型制作方法 健康新西蘭實驗兔購入后，先適應性飼養2周，然后C、D、E、F組肌肉注射DX 2 mg/kg，每周2次，為保證實驗的相對一致，A、B組肌肉注射2 ml生理鹽水。8周后，D、E、F、G、H組繼續維持DX肌肉注射，但劑量改為每周2 mg/kg。

1.6 治療方法及劑量 具體的治療方法及劑量按照目前成人治療標準確定。99TcMDP治療方法：將A瓶中99Tc液5 ml注入B瓶內，搖勻1 min后，用生理鹽水稀釋，以0.2 mg/kg（5 ml）對E組實驗兔進行耳靜脈推注治療，每周1次。氨基二膦酸鹽用水稀釋成每3 ml含0.2 mg，采用軟管喂服法，清晨給實驗兔服用，0.2 mg/kg，1次/d。骨康靈，以成人常規用量（每次150 ml，2次/d）按公斤體質量比例給實驗兔用藥，采用軟管喂服法，每次10 ml，2次/d。以上治療時間均為16周。

1.7 檢測項目 取第3腰椎（L3）和右側股骨頭進行病理細胞學分析以及骨形態計量分析。第4腰椎（L4）和左側股骨頭行骨密度和生物力學試驗。行X線攝片、CT攝片、核素骨骼掃描［取感興趣區（region of interest， ROI）膝關節與股骨中段的比較］，檢測治療后血清BGP、BALP指標（血清BALP檢測經56 ℃水浴處理20 min后進行檢測）。實驗兔DX注射8周時，測定A、C組實驗兔腰椎和股骨頭細胞學狀況、骨形態計量、骨密度、生物力學參數，行X線攝片、CT攝片和核素骨骼掃描，檢測血清BGP和BALP含量，分析A、C組以上指標的差異是否有統計學意義，以證實骨質疏松模型的建立與否。16周后，B、D、E、F、G和H組均測定上述與A、C組相同的實驗室檢測項目，分析B、D、E、F、G、H組之間的各項指標的差異是否具有統計學意義。

1.8 檢測步驟 實驗兔經適應性飼養后，C、D、E、F組均肌肉注射DX 2 mg/kg，每周2次，共治療8周，A、C組進行X線、CT攝片和核素骨骼掃描后處死，取腰椎和股骨頭進行病理切片細胞學分析、骨形態計量分析（骨小梁體積）、骨密度檢測和生物力學試驗，并取BALP、BGP測定用血清。16周后，B、D、E、F、G、H組進行上述與A、C組同樣的檢測過程后，處死實驗兔。

1.9 統計學方法 實驗數據用x±s表示，采用t檢驗。

2 結果 參考有關制作兔骨質疏松動物模型的資料［3］，C、D、E、F、G、H組實驗兔肌肉注射DX 2 mg/kg，每周2次，連續8周，然后對A、C組進行X線、CT攝片、核素同位素發射計算機輔助斷層顯像（emission computed tomography， ECT）骨骼顯像，處死后取血清測定BALP、BGP含量，同時取L3、右側股骨頭行病理切片分析，取L4、左側股骨頭和實驗兔的后肢膝關節行骨密度檢測和生物力學試驗，另對病理切片進行形態計量分析測定。檢測結果顯示A、C組以上各項指標的差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 A、C組實驗室檢測結果（略）

Table 1 Experimental parameters of groups A and C

**P＜0.01， vs group A.

病理細胞學顯示A組實驗兔骨小梁排列規則，呈正常骨組織形態。C組實驗兔骨小梁排列稀疏，存在較明顯的骨小梁斷裂現象，骨母細胞不易在視野中發現，稀疏和斷裂的骨小梁間存在脂肪組織填充，呈骨組織破壞形態。X線和CT攝片示B組的骨小梁較A組略顯稀疏，但不明顯。核素ECT骨骼顯像顯示C組實驗兔與A組相比較，C組各大關節的放射性攝取有所增強，而且骨骼顯像較模糊，以椎體更明顯。處死前C組實驗兔活動的靈敏度明顯低于A組。C組與A組的實驗室指標比較：左股骨頭、L4骨密度分別降低23.85%和28.39%；左股骨頭、L4骨生物力學分別降低52.19%和104.08%；骨形態計量降低80.98%；核素骨骼顯像和BALP、BGP分別升高9.21%和250%、41.64%；以上實驗室檢測結果顯示，采用激素DX注射實驗兔，兔骨質疏松動物模型成立。 第9周開始分別對E、F、G、H組進行99TcMDP、氨基二膦酸鹽、骨康靈治療和骨康靈聯合99TcMDP治療。連續治療16周后行X線攝片、CT攝片、核素骨骼顯像。X線攝片可見D組實驗兔的骨組織呈骨質疏松樣改變，股骨頭的骨質隱見斑塊狀、不均勻現象，基本與C組相似；B組骨組織為正常排列狀態，骨小梁排列整齊，也基本與A組相同。核素骨骼顯像見D組的骨組織放射性分布為增強和模糊現象，以椎體最為明顯，各大關節處放射性分布也增強。H組、E組骨骼顯像情況與B組的放射性分布基本相似，而F組的放射性分布還略優于G組。CT攝片顯示H組、E組骨組織顯像情況也基本與B組相同，但H組、E組的股骨頭顯示為骨組織透亮性增強、增白現象，F組則表現為股骨頭的透亮度有所增強，而D組股骨頭則為骨小梁稀疏、骨皮質明顯變薄和骨質疏松現象等表現，G組的骨形態學稍好于D組實驗兔。在飼養過程中，B組有一只實驗兔于第13周時死亡；D組2只分別在第11、14周死亡；G組1只于第14周死亡。死亡的實驗兔均為在購入時就比較瘦小，終因腹瀉而死亡。其他實驗兔的一般情況較正常。各組實驗兔的實驗室檢測結果見表2。 細胞學分析，B組與D組之間也存在較明顯的差異，病理切片顯示D組的骨小梁明顯稀疏，有斷裂和缺損區或凹陷，骨母細胞排列不清。B組骨小梁排列均勻、規則，與A組結構基本相似。H、E組的細胞學表現為骨質和骨小梁明顯得到了修復，骨小梁增粗。見圖1。F組的細胞學表現則優于G組，而G組略優于D組，H、E組明顯優于D組。

表2 治療16周實驗室檢測結果（略）

Table 2 Experimental parameters after 16week treatment

**P＜0.01， vs group D; △P＜0.05， vs group F; ▲P＜0.05， vs group G.

圖1 各組骨組織細胞學特征（略）

Figure 1 Cytology characteristics of bone tissue in different groups

A: Group B; B: Group D; C: Group E; D: Group F; E: Group G; F: Group H.

3 討論 骨質疏松癥是一種常見的疾病，會嚴重影響患者生活質量，尤其是需長期采用糖皮質激素維持治療的患者，該病的發病率更高。雖然臨床上治療骨質疏松癥的藥物較多［4］，但其療效不一。中西醫結合療法是一種非常有價值的臨床治療骨質疏松癥的方法［57］，可使中醫和西醫的療效互補。本實驗采用糖皮質激素DX誘導制作兔骨質疏松動物模型［3］，運用99TcMDP、氨基二膦酸鹽、骨康靈單獨治療和骨康靈聯合99TcMDP連續治療16周后，比較實驗室檢查各項指標，結果表明H、E組明顯優于D組(P<0.01)，H治療組骨密度、骨力學、骨形態計量、骨ALP和BGP檢測值優于F、G治療組(P<0.05)，但與E組比較，均值雖存在差異，但無統計學意義。結合病理切片，說明骨康靈聯合99TcMDP治療骨質疏松動物模型具有改善骨組織形態學的價值。 雙膦酸鹽類可在短時間內快速且強有力地吸附在骨組織的羥基磷灰石表面，在骨質代謝中能夠明顯抑制破骨細胞的活性。99TcMDP是一種經過衰變的放射性同位素99Tc標記在MDP結構上的化合物。99TcMDP與骨骼顯像劑99TcmMDP的化學結構相同，物理性質不同（后者99Tcm具有放射性示蹤作用，而前者99Tc沒有m，則沒有示蹤作用），因此存在骨質疏松者在骨骼掃描時就能顯示99TcmMDP在骨組織中的分布和骨損傷的情況。99TcMDP進入人體1～2 h內約有75%與骨組織的蛋白質結合，沉積在羥基磷灰石表面，有很好的親骨性［1］。有資料報道，99Tc在人體內具有調節機體免疫功能的作用，能清除人體內自由基，保護過氧化物歧化酶的活力，因此也有醫院采用99TcMDP治療免疫系統的疾?。?］，如甲狀腺機能亢進性凸眼、類風濕性關節炎、強直性脊椎炎以及銀屑病性關節病等，取得了較好療效。MDP是一種雙膦酸鹽化合物，與抑制破骨細胞的功能和抑制骨鈣的流失有關，MDP的這項功能已被學術界所公認。99TcMDP與單純的膦酸鹽藥物治療骨質疏松動物模型的研究結果提示99TcMDP治療骨質疏松癥的療效優于單純的雙膦酸鹽化合物［3］，所以99TcMDP不僅具有雙膦酸鹽的作用，在骨組織的代謝中可能還存在某種復合型功效。 祖國醫學認為筋骨與肝腎二臟關系密切。骨康靈由中藥炙黃芪、骨碎補、鹿角片、紅花等藥為主要成分組成，從益氣活血、補肝腎、壯筋骨入手，對骨組織的生長和代謝能起到促進作用，動物實驗顯示該方治療骨質疏松有一定的療效。現代中藥藥理研究發現補腎中藥可以有效地防止卵巢切除大鼠的骨礦物質丟失和股骨抗彎強度的下降，但不能使已經丟失的礦物質含量和降低的抗彎強度恢復，其部分機制是通過補腎中藥微弱的性激素樣作用降低骨轉化而抑制骨吸收，但性激素樣作用可能不是主要作用［9］。此外，有研究表明女性腎虛患者血中雌二醇與睪酮比例下降，而給予補腎中藥治療后，患者雌二醇與睪酮比值升高，甚至恢復到正常水平。這可能是其改善患者腎虛癥狀的機制之一［10］。 本實驗的結果顯示H治療組患者的骨代謝指標優于F治療組和G治療組(P<0.05)，在部分檢測指標均值方面也略優于E組，但差異無統計學意義。

【參考文獻】 1 Sun D. Radioactive nuclide bone imaging. Hangzhou: Zhejiang University Press. 2000: 238240. Chinese. 孫達. 放射性核素骨顯像. 杭州: 浙江大學出版社. 2000: 238240. 2 Pan HL， He D. Changes of biochemical indexes of bone metabolism for evaluation of the characteristics in patients with senile osteoporosis. Zhongguo Lin Chuang Kang Fu. 2004; 8(18): 35963597. Chinese with abstract in English. 潘宏良， 何德. 老年性骨質疏松癥患者骨代謝生化指標變化對其特征的評估應用. 中國臨床康復. 2004; 8(18): 35963597. 3 Gao KJ， Ye ZW， Li W， et al. The study of 99TcMDP and BONING in the treatment on the animal osteoporosis model. Zhonghua Yi Xue Shi Jian Za Zhi. 2005; 4(9): 865867. Chinese with abstract in English. 高克加， 葉智衛， 李偉， 等. 99TcMDP與“博寧”治療骨質疏松動物模型分析. 中華醫學實踐雜志. 2005; 4(9): 865867. 4 Zhao WX， Li JH. Pharmacotherapy progresses of osteoporosis. Yi Xue Yan Jiu Sheng Xue Bao. 2003; 16(5): 386388. Chinese with abstract in English. 趙文新， 李金恒. 骨質疏松癥的藥物治療進展. 醫學研究生學報. 2003; 16(5): 386388. 5 Sun J， Zhuge TY， Wang XX. A clinical study on the treatment of primary osteoporosis (POP) by "Migu" Capsule. Zhongguo Zhong Yi Gu Shang Ke Za Zhi. 2003; 11(6): 3740. Chinese with abstract in English. 孫捷， 諸葛天瑜， 王西迅， 等. 密骨膠囊治療老年性骨質疏松癥療效觀察. 中國中醫骨傷科雜志. 2003; 11(6): 3740. 6 Dong YL. Clinical observation of Liuwei Dihuang Pill in treatment of 60 cases of osteoporosis with deficiency syndrome. Zhong Yi Yao Lin Chuang Za Zhi. 2004; 16(2): 135136. Chinese. 董月靈. 濃縮六味地黃丸配合西藥治療腎陰虛型老年性骨質疏松癥60例臨床觀察. 中醫藥臨床雜志. 2004; 16(2): 135136. 7 Tang FY， Shi ZY. Clinical observation of integrated traditional Chinese and Western medicine therapy on osteoporotic fracture of thoracic and lumbar vertebra. Guangxi Zhong Yi Xue Yuan Xue Bao. 2004; 7(2): 3132. Chinese. 唐鳳元， 石展英. 中西醫結合治療骨質疏松性胸腰椎骨折療效觀察. 廣西中醫學院學報. 2004; 7(2): 3132. 8 Ma JX， Liu XJ. Practical clinical nuclear medicine. Beijing: Atomic Energy Press. 2002: 516521. Chinese. 馬寄曉， 劉秀杰. 實用臨床核醫學. 北京: 原子能出版社. 2002: 516521. 9 Song XW， Shi YY， Shen PZ. Effect of Chinese kidneytonifying drug on the bone of osteoporotic rat. Zhongguo Gu Shang. 1997; 10(5): 1314. Chinese. 宋獻文， 石印玉， 沈培芝. 補腎中藥對骨質疏松大鼠骨骼的影響. 中國骨傷. 1997; 10(5): 1314. 10 Song XW， Song ZJ， Shen PZ. Clinical observation on Chinese herbs for invigorating kidney on bone mineral density in women with postmenopausal osteoporosis. Shi Yong Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 1997; 10(9): 892. Chinese.