作者：田登科， 陳剛領， 李亞娟， 胡送友， 劉俊，卞卡

【摘要】 目的觀察云南白藥(YNBY)對自發性高血壓大鼠(SHR)腎臟炎癥狀態的影響，探討其對高血壓腎臟疾病的防治作用及機制。方法將6周齡SHR分為YNBY治療組和高血壓模型對照組，在3個時間點(給藥6周，給藥14周，停藥后9周)研究YNBY對SHR血壓值、腎臟炎性因子表達和氧化應激水平的影響。結果YNBY對SHR無明顯降壓作用(P>0.05)。YNBY在mRNA和蛋白水平抑制了細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)在SHR腎臟的高表達(P<0.05)。 YNBY在給藥14周和停藥9周時降低了過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的mRNA表達(P<0.05)，在給藥14周時明顯降低了PPARγ的蛋白表達(P<0.05)。YNBY給藥后顯著降低了SHR腎臟組織蛋白羰基化水平(P<0.05)，在給藥14周及停藥9周后均可顯著提高SHR腎臟總抗氧化能力(P<0.05)。結論YNBY給藥后能夠顯著減輕SHR腎臟炎癥反應和氧化應激水平，YNBY可能在防治高血壓腎病方面具有一定的療效。

【關鍵詞】 云南白藥; 自發性高血壓大鼠; 高血壓腎臟疾病; 炎癥反應

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of YunNanBaiYao(YNBY)on inflammatory status of the kidney from spontaneously hypertensive rats (SHR)， and to explore preventive and therapeutic usage of YNBY on hypertensive nephropathy. Methods6 weeks old SHR were pided into SHR control group and SHR-YNBY group.The effects of YNBY on systolic blood pressure， expression of inflammation-related factors and level of oxidative stress were determined at 3 time points: 6 weeks of YNBY treatment; 14 weeks of YNBY treatment; and 9 weeks post-YNBY treatment.ResultsYNBY did not affect the elevation of blood pressure of SHR(P>0.05). However， the TCM compound inhibited the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) at both mRNA and protein levels (P<0.05). At the time points of 14 weeks of treatment and 9 weeks post-treatment， HMP significantly attenuated peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ) mRNA expression (P<0.05). The protein level of PPARγ was also inhibited by YNBY markedly after 14 weeks of treatment (P<0.05). YNBY significantly reduced protein carbonyl contents of SHR kidney (P<0.05). In addition， after 14 weeks of treatment， YNBY increased total anti-oxidant capacity of renal tissue from SHR (P<0.05) and this elevated anti-oxidant capacity was even maintained for 9 weeks after treatment (P<0.05). ConclusionYNBY can reduce the inflammatory status and oxidative stress of SHR kidney， which may serve as the base for the advanced therapeutic utility of YNBY in hypertensive renal disease.

Key words：YunNanBaiYao (YNBY); Spontaneously hypertensive rat (SHR); Hypertensive nephropathy; Inflammation

腎臟是高血壓的重要靶器官之一。最近研究表明，炎癥反應不僅參與了高血壓疾病的發生發展，更是與高血壓心、腦、腎等多個靶器官損害密切相關[1]。炎癥反應不僅可導致腎臟纖維化和腎單位的損傷，同時也參與了腎小球濾過膜的破壞，因此抗炎相關治療已經成為防治高血壓腎臟疾病新的重要環節。云南白藥(YNBY)由云南民間醫生曲煥章于1902年研制成功，具有活血消腫、止血止痛的功效，臨床上可有效應用于多種出血性疾病的治療[2]。近年來隨著中醫藥學現代化研究的深入，YNBY的臨床應用也在不斷地得到拓展。本研究將觀察YNBY對SHR腎臟炎癥狀態的影響，進一步明確其作用環節和機理，為開拓其在防治高血壓腎臟疾病方面的臨床應用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物與藥物SPF級SHR 48只，WKY大鼠24只，均為雄性，6周齡，購自中科院上海實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0005。YNBY購自云南白藥集團公司(批號20051005)。

1.2 試劑與儀器Trizol 試劑購自美國Sigma-Aldich 公司;RT-PCR 試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司;引物合成自上海生工生物工程技術有限公司;抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology Inc公司。PCR擴增儀：德國Biometra 公司;GIS凝膠圖像分析系統：上海天能科技有限公司;無創尾動脈血壓測定分析系統：上海奧爾科特生物科技有限公司;酶標儀Spectra Max 190：美國Molecular Devices公司;分光光度計UV-1700：日本Shimadzu公司。其它試劑為國產分析純。

2 方法

2.1 動物分組及給藥將48只SHR隨機分為YNBY組和高血壓模型組，每組24只，以24只同周齡的WKY大鼠為正常對照。將YNBY溶于蒸餾水中灌胃給藥，藥物濃度為20 mg/ml，日用藥量為200 mg/kg，SHR模型組和WKY對照組大鼠每日按10 ml/kg灌胃蒸餾水。分別在給藥6周、給藥14周和停藥9周后分3批處理動物。

2.2 檢測指標

2.2.1 血壓測定采用無創測量大鼠血壓的裝置進行尾動脈收縮壓測定。測定前將大鼠置于35℃恒溫箱中預熱10 min，然后測量大鼠在安靜、清醒狀態下的尾動脈壓4～6次，取其平均值。每周定時進行測定一次。

2.2.2 動物處理及腎臟組織總RNA、蛋白提取大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，頸椎脫臼處死，取出腎臟組織液氮速凍后-80℃保存，用于總RNA、蛋白樣品制備。取大鼠凍存腎臟組織50～100 mg，加1 ml Trizol試劑，按照試劑使用說明提取總RNA，所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0之間。取大鼠腎臟組織約200 mg，在2 ml中含有蛋白酶抑制劑的 PBS(pH 7.4)中勻漿組織，4℃離心15 min兩次，取上清即為總蛋白樣本。

2.2.3 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)按照RT試劑盒說明書進行cDNA的合成，PCR擴增所需引物序列及反應條件如表1所示，β-actin作為內參照。擴增產物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以上海天能圖像分析系統對所得條帶光密度進行掃描分析。表1 PCR反應所需引物序列及條件

2.2.4 蛋白質印跡(Western-blot)分析用Lowry法測定蛋白濃度后，按照每孔50 μg蛋白樣品上樣。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，電轉移蛋白至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗ICAM-1(1∶200)、iNOS(1∶400)、β-actin(1∶1000)4℃過夜。PBS-T洗膜3×5 min后，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的相應二抗(1∶5000)室溫孵育1h，化學發光法進行顯色反應，最后在暗室中顯影定影。

2.2.5 腎臟組織總抗氧化能力測定采用高鐵還原抗氧化能力(FRAP)測定法。5 μl腎臟組織蛋白樣品和245 μl FRAP工作液在37℃反應10 min后，分別以PBS 和水溶性維生素-E(Trolox)作為空白和標準對照，于593 nm處測定吸光度值。

2.2.6 腎臟組織蛋白羰基化水平測定采用2，4-二硝基苯肼(DNPH)法測定腎臟組織蛋白羰基化水平。蛋白質被氧化后形成的羰基可與DNPH反應生成紅棕色的沉淀2，4-二硝基苯腙，將沉淀用鹽酸胍溶解后于370 nm處讀取吸光度值，從而測定蛋白質的羰基含量。羰基濃度以摩爾消光系數22.0 mmol/(L·cm)計算，羰基含量用每毫克蛋白中含有多少nmol的羰基來表示。

2.3 統計分析所有數據以±s表示，數據分析采用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 YNBY對SHR血壓值的影響結果見表2。模型組SHR收縮壓較正常對照WKY大鼠明顯升高(P<0.05)。給藥YNBY 6周，14周及停藥9周后，SHR的收縮壓與模型組大鼠比較無明顯差異(P>0.05)。表2 YNBY對SHR血壓值的影響與WKY組比較，▲P<0.05;與SHR模型組比較，■P>0.05;n=8

3.2 YNBY對SHR腎臟ICAM-1和eNOS表達的影響見圖1(a)、1(b)、1(c)，模型組大鼠腎臟eNOS和ICAM-1的mRNA表達顯著高于正常組(P<0.05)，YNBY治療后(給藥6周，給藥14周，停藥9周)可顯著降低SHR腎臟eNOS和ICAM-1的mRNA表達水平(P<0.05)。如圖2(a)、2(b)、2(c)所示，與WKY大鼠比較，模型組SHR腎臟可見eNOS和ICAM-1蛋白的高表達(P<0.05)。在各處理批次(給藥6周，給藥14周，停藥9周)YNBY均能夠顯著降低eNOS 和ICAM-1的表達水平(P<0.05)。

3.3 YNBY對SHR腎臟PPARγ表達的影響如圖1(a)、1(d)所示，模型組大鼠腎臟PPARγ mRNA表達顯著高于正常組(P<0.05)。YNBY給藥6周后對PPARγ的表達無明顯影響(P>0.05)，在給藥14周和停藥9周后可明顯降低其mRNA水平(P<0.05)。如圖2(a)、2(d)所示，與WKY大鼠比較，在各處理周齡模型組大鼠PPARγ的蛋白表達均有明顯提高 (P<0.05)。YNBY在給藥6周及停藥9周后對PPARγ的蛋白表達無明顯影響(P>0.05)，而在給藥14周時能夠顯著抑制PPARγ的高表達(P<0.05)。

3.4 YNBY對SHR腎臟總抗氧化能力的影響見表3。模型組SHR在20，29周齡時腎臟總抗氧化能力相對于WKY大鼠明顯降低(P<0.05)。YNBY給藥6周后，SHR總抗氧化能力與模型組大鼠比較有提高趨勢(P>0.05)，在給藥14周和停藥9周時SHR腎臟總抗氧化能力明顯提高(P<0.05)。表3 YNBY對SHR腎臟總抗氧化能力的影響

3.5 YNBY對SHR腎臟蛋白羰基化水平的影響見表4。與WKY組比較，SHR模型組腎臟蛋白羰基化水平顯著提高(P<0.05)。YNBY給藥后，SHR蛋白羰基化水平與SHR模型組大鼠比較明顯降低(P<0.05)。表4 YNBY對SHR腎臟蛋白羰基化水平的影響與WKY組比較，▲P<0.05;與SHR模型組比較，●P<0.05;n=8

4 討論

腎臟是高血壓的重要靶器官之一，高血壓腎病可導致很高的高血壓病致死、致殘率。目前關于高血壓腎臟損傷的發病機理有許多學說和解釋，國際最新研究表明發生于腎臟的慢性炎癥反應是高血壓腎臟損傷的重要病變因素。成年SHR腎臟纖維化、蛋白尿和肌酐清除率降低明顯，同時伴隨著腎臟炎癥因子的高表達和氧化應激的發生[3，4]。

YNBY自從20世紀初行銷于世以來，譽滿中外，歷久不衰，被譽為傷科圣藥。我們研究中心首次對YNBY的心血管系統現代藥理學作用進行了創新性審視，認為YNBY可能在抑制炎癥反應、保護血管內皮、降低氧化應激方面具有一定作用，而有關YNBY在此方面的應用卻未見報道。本研究將通過觀察YNBY對SHR腎臟炎癥狀態的影響，探索其對高血壓時腎臟損害的保護作用及機理。

動脈壓增高是高血壓時腎臟發生病變的重要誘因。然而研究表明，在血壓未升高的幼齡SHR腎間質中便存在著單核/巨噬細胞的浸潤和NADPH氧化酶的活化，這表明炎癥反應和氧化應激可能不依賴于血壓值的增高而引發腎臟損傷[5]。在保護高血壓靶器官損傷、降低高血壓各種臨床終點事件中，降壓也并非是唯一重要的療法，這可以從HMP及他汀類藥物能夠獨立于血壓值之外減輕高血壓并發癥中得到證明[6，7]。

腎臟炎癥反應發生時，腎小管上皮細胞ICAM-1 和血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)表達增加，二者可能介導了白細胞從小管周圍毛細血管內皮細胞到腎臟間質的遷移[8]。成年SHR腎小球細胞和血管內皮細胞ICAM-1蛋白表達明顯提高，大量單核細胞浸潤腎小球，24h尿蛋白量增多，并且核轉錄因子-κB (NF-κB)的活化與ICAM-1的表達及單核細胞浸潤、尿蛋白量均呈明顯正相關[9]，提示原發性高血壓時活化的NF-κB可通過上調腎組織ICAM-1 基因表達，促進單核細胞浸潤腎組織從而引發腎臟損害。生理條件下由eNOS產生的NO在調節血管張力、抑制血小板聚集和白細胞黏附、抑制血管平滑肌細胞(VSMC)增殖方面起了重要作用。然而在多種病理狀況下往往伴隨著eNOS脫偶聯的現象，此時eNOS不再產生NO而是產生大量的氧自由基，而且過氧化氫能夠刺激eNOS在血管壁的代償性增高[10，11]。實驗結果表明SHR腎臟eNOS較WKY明顯提高，提示SHR腎臟eNOS脫偶聯病理現象的存在。YNBY能夠顯著降低SHR腎臟eNOS的表達水平，表明YNBY可通過干預eNOS脫偶聯的現象而起到腎臟的保護作用。同時在本研究中，YNBY在mRNA和蛋白水平降低了SHR腎臟ICAM-1的表達，提示YNBY對發生于SHR腎臟的慢性低度炎癥反應具有顯著的抑制作用。

PPARγ具有抗炎和抗氧化作用。在Fischer 344大鼠腎臟中PPARγ通過抑制p65核易位和NF-κB的結合活性，從而降低了誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、 環氧合酶-2(COX-2)、 IL-1β、 IL-6和VCAM-1的表達[12]。在原代培養的血管內皮細胞中PPARγ可同時上調銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的表達和下調還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞單位phox22的表達[13]。然而，在腎臟纖維化實驗動物模型中PPARγ卻呈高表達，而且羅格列酮降低了PPARγ的表達水平[14，15]。與此相似本研究發現PPARγ在SHR腎臟組織中高表達，這可能是機體對炎癥及氧化損害所發生的一種代償性反應，推測YNBY對炎癥反應和氧化應激的抑制可能是下調PPARγ表達的作用機理。同時在本研究中YNBY治療后對PPARγ的mRNA和蛋白表達雖有降低作用，但沒有出現同步變化。考慮到PPARγ的轉錄活性不僅與其mRNA及蛋白表達水平有關，還與PPARγ翻譯后修飾如泛素化和N-末端磷酸化、抑制劑調節等多種因素密切關聯[16]，YNBY對PPARγ活性的具體影響及機制尚有待進一步研究。

炎癥發生時多伴隨氧化應激水平的增高。活性氧(ROS)可通過直接氧化修飾蛋白質、脂質、糖類和DNA造成組織損傷;ROS還可上調NF-κB的活性和轉化生長因子-β(TGF-β)的表達，進而引發局部的炎癥反應和纖維化過程[17，18];ROS可通過負向調節L-Arg的轉運[19]，氧化失活BH4[20]，氧化eNOS的鋅指結構造成eNOS脫偶聯[10]，因此ROS被認為是導致eNOS脫偶聯和內皮功能損傷的核心機制。含氮自由基過氧化硝酸鹽(ONOO-)還可與CuZn-SOD分子結構域中的Cu發生反應，在SOD分子上將酪氨酸殘基硝基化，SOD自身硝基化后其清除ROS的能力會顯著降低[21]。研究表明在轉基因Ren-2大鼠腎臟中，NADPH氧化酶的活化和ROS的過量產生造成了足細胞足突消失和微動脈纖維化等腎臟損害[22]。總抗氧化能力可以反映機體的氧自由基代謝狀況——總抗氧化能力降低表明機體氧自由基清除不足，生成相對過量，而蛋白羰基化含量可用來衡量蛋白質氧化損傷的程度。YNBY組分中的麝香、重樓、三七均具有顯著的抗氧化作用。本研究發現YNBY給藥后明顯提高了SHR腎臟組織的總抗氧化能力，同時降低了蛋白質氧化損傷程度，提示YNBY可通過抗氧化應激作用保護高血壓腎臟損傷。

總之，本研究證明YNBY對SHR血壓值無明顯影響，然而能夠通過抑制SHR腎臟炎性因子的表達，減輕氧化應激改善高血壓時發生于腎臟的炎癥反應，提示HMP在高血壓腎臟疾病的防治方面具有一定的應用潛能。關于YNBY對SHR腎臟纖維化、硬化及腎小球濾過膜包括血管內皮細胞、基膜和足細胞裂孔形態學的影響尚需進一步研究和觀察。