作者：田登科， 陳剛領(lǐng)， 李亞娟， 胡送友， 劉俊，卞卡

【摘要】 目的觀察云南白藥(YNBY)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腎臟炎癥狀態(tài)的影響，探討其對(duì)高血壓腎臟疾病的防治作用及機(jī)制。方法將6周齡SHR分為YNBY治療組和高血壓模型對(duì)照組，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(給藥6周，給藥14周，停藥后9周)研究YNBY對(duì)SHR血壓值、腎臟炎性因子表達(dá)和氧化應(yīng)激水平的影響。結(jié)果YNBY對(duì)SHR無明顯降壓作用(P>0.05)。YNBY在mRNA和蛋白水平抑制了細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在SHR腎臟的高表達(dá)(P<0.05)。 YNBY在給藥14周和停藥9周時(shí)降低了過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的mRNA表達(dá)(P<0.05)，在給藥14周時(shí)明顯降低了PPARγ的蛋白表達(dá)(P<0.05)。YNBY給藥后顯著降低了SHR腎臟組織蛋白羰基化水平(P<0.05)，在給藥14周及停藥9周后均可顯著提高SHR腎臟總抗氧化能力(P<0.05)。結(jié)論YNBY給藥后能夠顯著減輕SHR腎臟炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，YNBY可能在防治高血壓腎病方面具有一定的療效。

【關(guān)鍵詞】 云南白藥; 自發(fā)性高血壓大鼠; 高血壓腎臟疾病; 炎癥反應(yīng)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of YunNanBaiYao(YNBY)on inflammatory status of the kidney from spontaneously hypertensive rats (SHR)， and to explore preventive and therapeutic usage of YNBY on hypertensive nephropathy. Methods6 weeks old SHR were pided into SHR control group and SHR-YNBY group.The effects of YNBY on systolic blood pressure， expression of inflammation-related factors and level of oxidative stress were determined at 3 time points: 6 weeks of YNBY treatment; 14 weeks of YNBY treatment; and 9 weeks post-YNBY treatment.ResultsYNBY did not affect the elevation of blood pressure of SHR(P>0.05). However， the TCM compound inhibited the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) at both mRNA and protein levels (P<0.05). At the time points of 14 weeks of treatment and 9 weeks post-treatment， HMP significantly attenuated peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ) mRNA expression (P<0.05). The protein level of PPARγ was also inhibited by YNBY markedly after 14 weeks of treatment (P<0.05). YNBY significantly reduced protein carbonyl contents of SHR kidney (P<0.05). In addition， after 14 weeks of treatment， YNBY increased total anti-oxidant capacity of renal tissue from SHR (P<0.05) and this elevated anti-oxidant capacity was even maintained for 9 weeks after treatment (P<0.05). ConclusionYNBY can reduce the inflammatory status and oxidative stress of SHR kidney， which may serve as the base for the advanced therapeutic utility of YNBY in hypertensive renal disease.

Key words：YunNanBaiYao (YNBY); Spontaneously hypertensive rat (SHR); Hypertensive nephropathy; Inflammation

腎臟是高血壓的重要靶器官之一。最近研究表明，炎癥反應(yīng)不僅參與了高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展，更是與高血壓心、腦、腎等多個(gè)靶器官損害密切相關(guān)[1]。炎癥反應(yīng)不僅可導(dǎo)致腎臟纖維化和腎單位的損傷，同時(shí)也參與了腎小球?yàn)V過膜的破壞，因此抗炎相關(guān)治療已經(jīng)成為防治高血壓腎臟疾病新的重要環(huán)節(jié)。云南白藥(YNBY)由云南民間醫(yī)生曲煥章于1902年研制成功，具有活血消腫、止血止痛的功效，臨床上可有效應(yīng)用于多種出血性疾病的治療[2]。近年來隨著中醫(yī)藥學(xué)現(xiàn)代化研究的深入，YNBY的臨床應(yīng)用也在不斷地得到拓展。本研究將觀察YNBY對(duì)SHR腎臟炎癥狀態(tài)的影響，進(jìn)一步明確其作用環(huán)節(jié)和機(jī)理，為開拓其在防治高血壓腎臟疾病方面的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物SPF級(jí)SHR 48只，WKY大鼠24只，均為雄性，6周齡，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。YNBY購(gòu)自云南白藥集團(tuán)公司(批號(hào)20051005)。

1.2 試劑與儀器Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldich 公司;RT-PCR 試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司;引物合成自上海生工生物工程技術(shù)有限公司;抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology Inc公司。PCR擴(kuò)增儀：德國(guó)Biometra 公司;GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司;無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)：上海奧爾科特生物科技有限公司;酶標(biāo)儀Spectra Max 190：美國(guó)Molecular Devices公司;分光光度計(jì)UV-1700：日本Shimadzu公司。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥將48只SHR隨機(jī)分為YNBY組和高血壓模型組，每組24只，以24只同周齡的WKY大鼠為正常對(duì)照。將YNBY溶于蒸餾水中灌胃給藥，藥物濃度為20 mg/ml，日用藥量為200 mg/kg，SHR模型組和WKY對(duì)照組大鼠每日按10 ml/kg灌胃蒸餾水。分別在給藥6周、給藥14周和停藥9周后分3批處理動(dòng)物。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 血壓測(cè)定采用無創(chuàng)測(cè)量大鼠血壓的裝置進(jìn)行尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定。測(cè)定前將大鼠置于35℃恒溫箱中預(yù)熱10 min，然后測(cè)量大鼠在安靜、清醒狀態(tài)下的尾動(dòng)脈壓4～6次，取其平均值。每周定時(shí)進(jìn)行測(cè)定一次。

2.2.2 動(dòng)物處理及腎臟組織總RNA、蛋白提取大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，頸椎脫臼處死，取出腎臟組織液氮速凍后-80℃保存，用于總RNA、蛋白樣品制備。取大鼠凍存腎臟組織50～100 mg，加1 ml Trizol試劑，按照試劑使用說明提取總RNA，所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0之間。取大鼠腎臟組織約200 mg，在2 ml中含有蛋白酶抑制劑的 PBS(pH 7.4)中勻漿組織，4℃離心15 min兩次，取上清即為總蛋白樣本。

2.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)按照RT試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，PCR擴(kuò)增所需引物序列及反應(yīng)條件如表1所示，β-actin作為內(nèi)參照。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以上海天能圖像分析系統(tǒng)對(duì)所得條帶光密度進(jìn)行掃描分析。表1 PCR反應(yīng)所需引物序列及條件

2.2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)分析用Lowry法測(cè)定蛋白濃度后，按照每孔50 μg蛋白樣品上樣。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗ICAM-1(1∶200)、iNOS(1∶400)、β-actin(1∶1000)4℃過夜。PBS-T洗膜3×5 min后，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5000)室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后在暗室中顯影定影。

2.2.5 腎臟組織總抗氧化能力測(cè)定采用高鐵還原抗氧化能力(FRAP)測(cè)定法。5 μl腎臟組織蛋白樣品和245 μl FRAP工作液在37℃反應(yīng)10 min后，分別以PBS 和水溶性維生素-E(Trolox)作為空白和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，于593 nm處測(cè)定吸光度值。

2.2.6 腎臟組織蛋白羰基化水平測(cè)定采用2，4-二硝基苯肼(DNPH)法測(cè)定腎臟組織蛋白羰基化水平。蛋白質(zhì)被氧化后形成的羰基可與DNPH反應(yīng)生成紅棕色的沉淀2，4-二硝基苯腙，將沉淀用鹽酸胍溶解后于370 nm處讀取吸光度值，從而測(cè)定蛋白質(zhì)的羰基含量。羰基濃度以摩爾消光系數(shù)22.0 mmol/(L·cm)計(jì)算，羰基含量用每毫克蛋白中含有多少nmol的羰基來表示。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 YNBY對(duì)SHR血壓值的影響結(jié)果見表2。模型組SHR收縮壓較正常對(duì)照WKY大鼠明顯升高(P<0.05)。給藥YNBY 6周，14周及停藥9周后，SHR的收縮壓與模型組大鼠比較無明顯差異(P>0.05)。表2 YNBY對(duì)SHR血壓值的影響與WKY組比較，▲P<0.05;與SHR模型組比較，■P>0.05;n=8

3.2 YNBY對(duì)SHR腎臟ICAM-1和eNOS表達(dá)的影響見圖1(a)、1(b)、1(c)，模型組大鼠腎臟eNOS和ICAM-1的mRNA表達(dá)顯著高于正常組(P<0.05)，YNBY治療后(給藥6周，給藥14周，停藥9周)可顯著降低SHR腎臟eNOS和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。如圖2(a)、2(b)、2(c)所示，與WKY大鼠比較，模型組SHR腎臟可見eNOS和ICAM-1蛋白的高表達(dá)(P<0.05)。在各處理批次(給藥6周，給藥14周，停藥9周)YNBY均能夠顯著降低eNOS 和ICAM-1的表達(dá)水平(P<0.05)。

3.3 YNBY對(duì)SHR腎臟PPARγ表達(dá)的影響如圖1(a)、1(d)所示，模型組大鼠腎臟PPARγ mRNA表達(dá)顯著高于正常組(P<0.05)。YNBY給藥6周后對(duì)PPARγ的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)，在給藥14周和停藥9周后可明顯降低其mRNA水平(P<0.05)。如圖2(a)、2(d)所示，與WKY大鼠比較，在各處理周齡模型組大鼠PPARγ的蛋白表達(dá)均有明顯提高 (P<0.05)。YNBY在給藥6周及停藥9周后對(duì)PPARγ的蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05)，而在給藥14周時(shí)能夠顯著抑制PPARγ的高表達(dá)(P<0.05)。

3.4 YNBY對(duì)SHR腎臟總抗氧化能力的影響見表3。模型組SHR在20，29周齡時(shí)腎臟總抗氧化能力相對(duì)于WKY大鼠明顯降低(P<0.05)。YNBY給藥6周后，SHR總抗氧化能力與模型組大鼠比較有提高趨勢(shì)(P>0.05)，在給藥14周和停藥9周時(shí)SHR腎臟總抗氧化能力明顯提高(P<0.05)。表3 YNBY對(duì)SHR腎臟總抗氧化能力的影響

3.5 YNBY對(duì)SHR腎臟蛋白羰基化水平的影響見表4。與WKY組比較，SHR模型組腎臟蛋白羰基化水平顯著提高(P<0.05)。YNBY給藥后，SHR蛋白羰基化水平與SHR模型組大鼠比較明顯降低(P<0.05)。表4 YNBY對(duì)SHR腎臟蛋白羰基化水平的影響與WKY組比較，▲P<0.05;與SHR模型組比較，●P<0.05;n=8

4 討論

腎臟是高血壓的重要靶器官之一，高血壓腎病可導(dǎo)致很高的高血壓病致死、致殘率。目前關(guān)于高血壓腎臟損傷的發(fā)病機(jī)理有許多學(xué)說和解釋，國(guó)際最新研究表明發(fā)生于腎臟的慢性炎癥反應(yīng)是高血壓腎臟損傷的重要病變因素。成年SHR腎臟纖維化、蛋白尿和肌酐清除率降低明顯，同時(shí)伴隨著腎臟炎癥因子的高表達(dá)和氧化應(yīng)激的發(fā)生[3，4]。

YNBY自從20世紀(jì)初行銷于世以來，譽(yù)滿中外，歷久不衰，被譽(yù)為傷科圣藥。我們研究中心首次對(duì)YNBY的心血管系統(tǒng)現(xiàn)代藥理學(xué)作用進(jìn)行了創(chuàng)新性審視，認(rèn)為YNBY可能在抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮、降低氧化應(yīng)激方面具有一定作用，而有關(guān)YNBY在此方面的應(yīng)用卻未見報(bào)道。本研究將通過觀察YNBY對(duì)SHR腎臟炎癥狀態(tài)的影響，探索其對(duì)高血壓時(shí)腎臟損害的保護(hù)作用及機(jī)理。

動(dòng)脈壓增高是高血壓時(shí)腎臟發(fā)生病變的重要誘因。然而研究表明，在血壓未升高的幼齡SHR腎間質(zhì)中便存在著單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和NADPH氧化酶的活化，這表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可能不依賴于血壓值的增高而引發(fā)腎臟損傷[5]。在保護(hù)高血壓靶器官損傷、降低高血壓各種臨床終點(diǎn)事件中，降壓也并非是唯一重要的療法，這可以從HMP及他汀類藥物能夠獨(dú)立于血壓值之外減輕高血壓并發(fā)癥中得到證明[6，7]。

腎臟炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞ICAM-1 和血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)表達(dá)增加，二者可能介導(dǎo)了白細(xì)胞從小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞到腎臟間質(zhì)的遷移[8]。成年SHR腎小球細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)明顯提高，大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)腎小球，24h尿蛋白量增多，并且核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)的活化與ICAM-1的表達(dá)及單核細(xì)胞浸潤(rùn)、尿蛋白量均呈明顯正相關(guān)[9]，提示原發(fā)性高血壓時(shí)活化的NF-κB可通過上調(diào)腎組織ICAM-1 基因表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)腎組織從而引發(fā)腎臟損害。生理?xiàng)l件下由eNOS產(chǎn)生的NO在調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附、抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖方面起了重要作用。然而在多種病理狀況下往往伴隨著eNOS脫偶聯(lián)的現(xiàn)象，此時(shí)eNOS不再產(chǎn)生NO而是產(chǎn)生大量的氧自由基，而且過氧化氫能夠刺激eNOS在血管壁的代償性增高[10，11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SHR腎臟eNOS較WKY明顯提高，提示SHR腎臟eNOS脫偶聯(lián)病理現(xiàn)象的存在。YNBY能夠顯著降低SHR腎臟eNOS的表達(dá)水平，表明YNBY可通過干預(yù)eNOS脫偶聯(lián)的現(xiàn)象而起到腎臟的保護(hù)作用。同時(shí)在本研究中，YNBY在mRNA和蛋白水平降低了SHR腎臟ICAM-1的表達(dá)，提示YNBY對(duì)發(fā)生于SHR腎臟的慢性低度炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用。

PPARγ具有抗炎和抗氧化作用。在Fischer 344大鼠腎臟中PPARγ通過抑制p65核易位和NF-κB的結(jié)合活性，從而降低了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、 環(huán)氧合酶-2(COX-2)、 IL-1β、 IL-6和VCAM-1的表達(dá)[12]。在原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中PPARγ可同時(shí)上調(diào)銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的表達(dá)和下調(diào)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞單位phox22的表達(dá)[13]。然而，在腎臟纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中PPARγ卻呈高表達(dá)，而且羅格列酮降低了PPARγ的表達(dá)水平[14，15]。與此相似本研究發(fā)現(xiàn)PPARγ在SHR腎臟組織中高表達(dá)，這可能是機(jī)體對(duì)炎癥及氧化損害所發(fā)生的一種代償性反應(yīng)，推測(cè)YNBY對(duì)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的抑制可能是下調(diào)PPARγ表達(dá)的作用機(jī)理。同時(shí)在本研究中YNBY治療后對(duì)PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)雖有降低作用，但沒有出現(xiàn)同步變化。考慮到PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性不僅與其mRNA及蛋白表達(dá)水平有關(guān)，還與PPARγ翻譯后修飾如泛素化和N-末端磷酸化、抑制劑調(diào)節(jié)等多種因素密切關(guān)聯(lián)[16]，YNBY對(duì)PPARγ活性的具體影響及機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

炎癥發(fā)生時(shí)多伴隨氧化應(yīng)激水平的增高。活性氧(ROS)可通過直接氧化修飾蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和DNA造成組織損傷;ROS還可上調(diào)NF-κB的活性和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)局部的炎癥反應(yīng)和纖維化過程[17，18];ROS可通過負(fù)向調(diào)節(jié)L-Arg的轉(zhuǎn)運(yùn)[19]，氧化失活BH4[20]，氧化eNOS的鋅指結(jié)構(gòu)造成eNOS脫偶聯(lián)[10]，因此ROS被認(rèn)為是導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)和內(nèi)皮功能損傷的核心機(jī)制。含氮自由基過氧化硝酸鹽(ONOO-)還可與CuZn-SOD分子結(jié)構(gòu)域中的Cu發(fā)生反應(yīng)，在SOD分子上將酪氨酸殘基硝基化，SOD自身硝基化后其清除ROS的能力會(huì)顯著降低[21]。研究表明在轉(zhuǎn)基因Ren-2大鼠腎臟中，NADPH氧化酶的活化和ROS的過量產(chǎn)生造成了足細(xì)胞足突消失和微動(dòng)脈纖維化等腎臟損害[22]。總抗氧化能力可以反映機(jī)體的氧自由基代謝狀況——總抗氧化能力降低表明機(jī)體氧自由基清除不足，生成相對(duì)過量，而蛋白羰基化含量可用來衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的程度。YNBY組分中的麝香、重樓、三七均具有顯著的抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)YNBY給藥后明顯提高了SHR腎臟組織的總抗氧化能力，同時(shí)降低了蛋白質(zhì)氧化損傷程度，提示YNBY可通過抗氧化應(yīng)激作用保護(hù)高血壓腎臟損傷。

總之，本研究證明YNBY對(duì)SHR血壓值無明顯影響，然而能夠通過抑制SHR腎臟炎性因子的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激改善高血壓時(shí)發(fā)生于腎臟的炎癥反應(yīng)，提示HMP在高血壓腎臟疾病的防治方面具有一定的應(yīng)用潛能。關(guān)于YNBY對(duì)SHR腎臟纖維化、硬化及腎小球?yàn)V過膜包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和足細(xì)胞裂孔形態(tài)學(xué)的影響尚需進(jìn)一步研究和觀察。