作者：唐哲，文愛東，吳寅，趙磊，李宏力，石茹

【關鍵詞】 卡馬西平

Determination of carbamazepine concentration in human saliva by HPLC and its pharmacokinetic study

【Abstract】 AIM: To determine carbamazepine(CBZ) concentration in human saliva by HPLC and study its pharmacokinetics. METHODS: Shimpack CLCODS C18 (150 mm×6 mm， 5 μm) spectrum analytical column was used and methanolwater(53∶47)was adopted as the mobile phase. Flow rate was 1.0 mL?min-1， detection wavelength was 212 nm， column temperature was 23℃ and the dosage of CBZ was 50 μL. The pharmacokinetic parameters of CBZ tablets taken by 6 healthy volunteers at a single oral dose of 200 mg were calculated according to CBZ concentration in saliva. RESULTS: The standard curve was linear (r=0.999) within the range of 0.40~4.32 mg?L-1 for CBZ. The limit of detection in saliva was 30 μg?L-1 (S/N≥3). The average recovery was 99.17%-104.80%；the interday RSD and intraday RSD was 2.6%-4.9% and 3.0%-8.6% respectively.The results showed that the pharmacokinetics of CBZ was in accordance with the onecompartment open model. Tmax， Cmax， ke， T1/2 and AUC(0~inf) was (4.50±3.15) h， (1.52±0.22) mg?L-1， (0.0090±0.0006) h-1， (77.16±5.26) h and (132.18±8.82) mg ?h?L-1 respectively. After single dosing， the concentrationtime curve of CBZ in saliva presented multiple peaks. CONCLUSION: This method is simple， quick and specific， and can be used to determine CBZ concentration in human saliva and to study its pharmacokinetics.

【Keywords】 chromatography， high pressure liquid; carbamazepine; saliva; pharmacokinetics

【摘要】 目的： 利用HPLC法測定人唾液中卡馬西平濃度，并觀察其藥代動力學特征. 方法： 采用Shimpack CLCODS C18色譜分析柱 (150 mm×6 mm， 5 μm)，以甲醇水（53∶47）為流動相，流速為1.0 mL?min-1，檢測波長為212 nm，柱溫為室溫，進樣量50 μL. 根據(jù)唾液藥物濃度求算6名健康受試者單劑量口服卡馬西平片劑的藥代動力學參數(shù). 結(jié)果： 本測定方法線形范圍為0.40~4.32 mg?L-1，相關系數(shù)r=0.999，最低檢出濃度為30 μg?L-1 (按S/N≥3計)，方法平均回收率為99.17%-104.80%；日內(nèi)RSD、日間RSD分別在2.6%-4.9%和3.0%-8.6%. 藥動學參數(shù)表明，卡馬西平人體內(nèi)過程符合單室開放模型，Tmax， Cmax， ke， T1/2， AUC(0~inf) 分別為（4.50±3.15）h， (1.52±0.22) mg?L-1， (0.0090±0.0006) h-1， (77.16±5.26) h， (132.18±8.82) mg?h?L-1. 單次給藥后，CBZ唾液濃度時間曲線出現(xiàn)多峰現(xiàn)象. 結(jié)論： 該法簡便、快速、專一性強，適用于卡馬西平唾液藥物濃度測定及藥代動力學研究之用.

【關鍵詞】 色譜法，高壓液相；卡馬西平；唾液；藥代動力學

0引言

卡馬西平（carbamazepine， CBZ）是臨床上常用的抗癲癇藥. 由于此藥的藥代動力學個體差異大，吸收不規(guī)則，血藥濃度治療窗窄（4~12 mg?L-1），容易引起毒副反應［1］. 為保證藥品質(zhì)量及臨床療效，把好臨床合理用藥關［2-4］，有必要對其進行血藥濃度監(jiān)測和個體化用藥. 但血樣采集常增加患者痛苦，且操作較繁瑣［5］，尤其對于嬰幼兒更為不便. 而唾液取樣具有無創(chuàng)傷、經(jīng)濟簡便、易于接受等優(yōu)點. 為探討用無創(chuàng)傷性生物制品取代血樣的新途徑，通過監(jiān)測唾液中藥物濃度，實現(xiàn)個體化用藥，并在社區(qū)、家庭推廣，取代傳統(tǒng)的患者到醫(yī)院門診抽取血樣的不方便模式，我們利用HPLC法測定卡馬西平唾液濃度，并通過藥代動力學研究，考察其適用性［6］. 1材料和方法

1.1材料① 對象健康受試者6（男3，女3）名，年齡20~25歲，平均（22.2±1.8）歲；體質(zhì)量42~65 kg，平均（53.7±8.9） kg. 肝腎功能正常，受試前1 wk及受試期間未接受其他藥物. 每位受試者均自愿參加實驗，詳細了解實驗過程并簽署知情同意書. ② 儀器LC10AVP高效液相色譜系統(tǒng)（Shimadzu，Japan）：含兩臺LC10ATvp型泵，7725型進樣閥（配100 μL定量環(huán)），CTO10Asvp柱箱，Classvp 5.032色譜工作站(Shimadzu，Japan)，Shimpack CLCODS C18不銹鋼分析色譜柱（150 mm×6 mm，5 μm），3D紫外檢測器；渦旋混合器（XW80型，上海第一醫(yī)學院儀器廠）；高速離心機（ABBOTT，USA）. ③ 藥品與試劑卡馬西平片：上海復旦復華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20030123卡馬西平標準品：中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜級，其他試劑均為分析純. 1.2色譜條件色譜柱：Shimpack CLCODS C18柱（150 mm×6 mm，5 μm）；流動相：甲醇水(53∶47)；流速1 mL?min-1；檢測波長212 nm；柱溫為室溫；進樣量100 μL.

1.3方法

1.3.1CBZ標準液的制備精密稱取4.0 mg的CBZ標準品，置于50 mL量瓶中，用甲醇定容，即得濃度為0.08 g?L-1的CBZ標準液.

1.3.2標準曲線制備取正常人混合空白唾液1 mL 5份，分別加入CBZ標準液5，12，24，38和54 μL，配成濃度分別為0.40，0.96，1.92，3.04和4.32 mg?L-1的系列標準樣品. 取待測樣品150 μL，加入蛋白沉淀劑150 μL，振蕩混勻后高速離心5 min（4500 g），取上清液100 μL進樣. 以峰面積為縱坐標（A），CBZ濃度為橫坐標（C），進行線形回歸，得回歸方程：C=0.000003247A-0.1738(r=0.999， n=6)，唾液中CBZ濃度在0.4~4.3 mg?L-1范圍內(nèi)線形關系良好. CBZ的最低檢測濃度為30 μg?L-1（S/N≥3）.

1.3.3方法專屬性將空白唾液、CBZ標準溶液及供試樣品分別進樣，其三維圖譜分別見Fig 1. 在本色譜條件下，CBZ的保留時間為7.2 min，唾液中蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)與CBZ可達基線完全分離，確保分析方法的專一性.

1.3.4方法回收率和精密度按“標準曲線制備”項下操作，對已知含CBZ 0.40，1.92，4.32 mg ?L-1低、中、高3種濃度的唾液供試品，于同日內(nèi)連續(xù)測定5次，計算其日內(nèi)精密度；對上述3種濃度樣品于5 d內(nèi)分別進行測定，計算日間精密度；同時計算方法回收率(Tab 1).

1.3.5實驗設計6名受試者實驗前禁食12 h，于次日晨起空腹采集唾液2 mL(空白對照)，隨即口服CBZ片劑200 mg；并于服藥后1.5， 3， 4.5， 6， 7.5， 9， 10.5， 12， 24， 72， 144和216 h收集唾液2 mL，按“標準曲線制備”項下方法測定唾液中CBZ濃度.

表1HPLC法測定唾液中卡馬西平的方法回收率和精密度(略)

圖1卡馬西平色譜圖(略)

2結(jié)果

經(jīng)計算，6名健康受試者口服200 mg CBZ后的平均藥時曲線見Fig 2. 消除速率常數(shù)ke用消除相中對數(shù)藥物濃度時間回歸曲線的斜率求得，以梯形法求算AUC， Tmax， Cmax均采用實測值. 其主要藥動學參數(shù)Tmax， Cmax， ke， T1/2， AUC(0~inf)分別為（4.50±3.15）h， (1.52±0.22) mg?L-1， (0.0090±0.0006) h-1， (77.16±5.26) h， (132.18±8.82) mg ?h?L-1.

圖2健康受試者口服200 mg卡馬西平后的平均藥時曲線(略)

3討論 以HPLC法測定血液中CBZ的方法已有報道，其樣品預處理方法主要為液液萃取法［7-11］. 我們采用蛋白沉淀法，較萃取法回收率高，操作簡便快速、價廉，而且避免了有機試劑揮發(fā)給操作者帶來的健康損害. 本實驗建立的HPLC法測定唾液中的CBZ濃度，樣品處理方便，出峰快，10 min即可完成1個樣品分析，分析成本低. CBZ與樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離完全，具有較高的專一性. 以峰面積與唾液中藥物濃度之間的線形關系做定量標準，相關性好. 回收率及精密度試驗結(jié)果表明，本法回收完全，重現(xiàn)性良好，是一種靈敏、專一、快速、簡便的測定方法. 6名健康受試者單劑量口服CBZ片劑200 mg的唾液藥濃度經(jīng)時變化趨勢基本相似，但達峰時間具有較大的個體差異(4.50±3.15) h，與文獻報道的結(jié)果基本一致［12］，再次證明了對CBZ進行治療藥物監(jiān)測，實行個體化用藥的必要性. CBZ服藥后吸收較為迅速，T1/2較長，其人體內(nèi)的藥時曲線符合一級吸收的單室模型. 另外，本次試驗發(fā)現(xiàn)CBZ藥時曲線存在多峰現(xiàn)象，6名受試者中，4人出現(xiàn)三峰，2人出現(xiàn)雙峰，CBZ多峰現(xiàn)象可能與其胃腸道吸收的非齊性 (Unhomogeneous) 和腸肝循環(huán) (Enterhepatic Circulation，EHC)有關［12，13］. 本次試驗只是單劑量給藥，對CBZ片的多峰現(xiàn)象觀察還須在多次給藥達到穩(wěn)態(tài)時的狀態(tài)下繼續(xù)進行觀察. 對多峰現(xiàn)象的研究，可為臨床制訂更安全、有效、合理的給藥方案提供依據(jù)，減少不良反應的發(fā)生.

我們建立了簡便、快速檢測唾液中CBZ的方法，適用性良好，為以唾液進行CBZ治療藥物監(jiān)測提供了依據(jù)，也為進一步進行多中心臨床試驗，考察CBZ唾液濃度與CBZ臨床療效及不良反應發(fā)生率間的關系奠定了基礎.

［1］Jiao Z， Zhong MK， Shi XJ， Zhang JH. Simultaneous Determination of Carbamazepine， Carbamazepine10， 11epoxide，Phenytoin in Human Serum ［J］. Yaowu Fenxi Zazhi (Chin J Pharm Anal)， 2002；22（6）：445-449.

［2］Wen AD， Huang X， Jiang YP， Mei QB， Zhao L， Zhang L. Blood stasis in congestive heart failure bears relation with digoxin clinical pharmacokinetics ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao （J Fourth Mil Med Univ）， 2001；22（7）：631-634.

［3］Wen AD， Zhao L， Zhang SO， Jiang YP， Fan YX， Yang ZF. Relative bioequivalence and pharmacokinetics of amoxicillin?clavulanic acid in healthy volunteers ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao （J Fourth Mil Med Univ）， 2001；22(19)：1805-1808.

［4］Wen AD， Wang WZ， Song WL， Zhao L， Wu GS， Zhao JX. Inpidual medication of FK506 in the recipient of the first case of livingrelated small bowel transplantation in China ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao （J Fourth Mil Med Univ）， 2002；23（6）：540-542.

［5］Li J， Zhao XM， Zheng L， Zhu YY， Gao YS. RPHPLC determination of enoxacin in saliva ［J］. Yaowu Fenxi Zazhi (Chin J Pharm Anal)， 2002；22（3）：188-190.

［6］Wang XF， Wen AD， Zhao L， Luo XX， Mei QB， Zhao DH. Comparison between saliva and blood in pharmacokinetics of Tegretol ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao （J Fourth Mil Med Univ），2001；22(16)：1508-1511.

［7］Chen L， Luo WH， Li H， Zhang Y. Determination of phenytion and carbamazepine in blood serum by RPHPLC with UV detection ［J］. Zhongguo Yiyuan Yaoxue Zazhi (Chin J Hosp Pharm)， 2000；20(11):645-647.

［8］ Qi LM. Determination of phenytion，phenobarbitone and carbamazepine concentration in serum by HPLC ［J］. Huaxi Yaoxue Zazhi (West Chin J Pharm)， 2001；16（6）：455-456.

［9］ Mandrioli R， Albani F， Casamenti G， Sabbioni C， Raggia MA. Simultaneous highperformance liquid chromatography determination of carbamazepine and five of its metabolites in plasma of epileptic patients ［J］. J Chromatogr B Biomed Sci Appl， 2001;762(2)：109-116.

［10］ Levert H， Odou P， Robert H. Simultaneous determination of four antiepileptic drugs in serum by highperformance liquid chromatography ［J］. BiomedChromatogr， 2002； 16(1) ： 19-24.

［11］ Levert H， Odou P， Robert H. LC determination of oxcarbazepine and its active metabolite in human serum ［J］. J Pharm Biomed Anal， 2002; 28(34): 517-525.

［12］ Hu MY， Zheng P， Liu ST， Yang L， Huo QL. Comparative biovaliability of tegretol and two domestic carbamazepine tablets in nomal volunteers ［J］. Zhongguo Yiyuan Yaoxue Zazhi (Chin J Hosp Pharm)， 1998；18（10）：435-438.

［13］ Zheng P， Hu MY， Liu ST， Yang L.To simply analysis the multipeaks phenomenon of the plasma drug concentration of CBZ ［J］. Zhongguo Yaofang （Chin Pharm）， 1999；10（1）：45.