作者：尤海生，董亞琳，王茂義，董衛華，鄭鑫

【摘要】 目的 建立人血漿中羅紅霉素濃度的高效液相分析方法，用于研究羅紅霉素膠囊在人體的藥代動力學和生物等效性。方法 血漿樣品采用己烷異戊醇(98∶2)液液萃取，反相高效液相法測定。結果 羅紅霉素的線性范圍為0.25-32.06mg/L(r為0.9992)，最低檢出質量濃度為0.25mg/L，最低檢出量為12.5ng，提取回收率為68.0%-72.8%，方法回收率為90.7%-99.4%。單次服用300mg羅紅霉素膠囊受試制劑或參比制劑后的藥動學參數AUC0-48h、Cmax、tmax、t1/2分別為(101.84±27.69)(mg·h)/L和(103.5±30.83)(mg·h)/L，(8.54±1.95)mg/L和(8.07±1.81)mg/L，(1.6±0.6)h和(1.8±0.6)h，(10.4±2.9)h和(10.5±2.6)h。受試制劑相對生物利用度為(100.5±19.1)%。結論 該方法專一性較好，血漿內源性雜質無干擾，結果準確。羅紅霉素的兩種制劑間主要藥動學參數無明顯差異，具有生物等效性。

【關鍵詞】 羅紅霉素；HPLC；生物等效性；藥代動力學

Pharmacokinetics and bioequivalence of roxithromycin capsules in human

ABSTRACT: Objective To establish the method of assaying roxithromycin in human plasma by high performance liquid chromatography (HPLC)， and to study its pharmacokinetics and bioequivalence. Methods The plasma samples were extracted by hexane isoamylalcohol (98∶2) and reversed phase chromatography to determine the concentration of roxithromycin. Results The calibration curve was linear from 0.25mg/L to 32.06mg/L， the minimum concentration was 0.25mg/L(r=0.9992) and the minimum quantitation was 12.5ng. The extraction recovery rate was 68.0%-72.8% and the method recovery rate was 90.7%-99.4%. After a single oral dose of 300mg roxithromycin test or reference capsules， the main pharmacokinetic parameters were as follows: AUC0-48h(101.84±27.69)(mg·h)/L and (103.5±30.83)(mg·h)/L， Cmax(8.54±1.95)mg/L and (8.07±1.81)mg/L， tmax(1.6±0.6)h and (1.8±0.6)h， t1/2(10.4±2.9)h and (10.5±2.6)h， respectively. Relative bioavailability of the test fomulation was (100.5±19.1)%. Conclusion This method can be used in the analysis of roxithromycin in the plasma without endogenic substance interference. The method is specific and accurate. No significance difference exists among the main pharmacokinetic parameters for the test capsules and the reference capsules. The two formulations are bioequivalent.

KEY WORDS: roxithromycin; high performance liquid chromatography (HPLC); bioequivalence; pharmacokinetics

羅紅霉素是半合成的十四元大環內酯類抗生素，具有口服吸收好、半衰期長等特點。在較低波長處，羅紅霉素具有較高的吸收，可采取分光光度方法檢測。本實驗采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)測定血漿中羅紅霉素的含量，最低檢測濃度為0.25mg/L，可滿足羅紅霉素藥動學的研究。此方法簡便迅速，結果準確。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 受試制劑：羅紅霉素膠囊(T)，規格：150mg/粒，批號：030701，山東天順藥業股份有限公司生產。參比制劑：羅紅霉素膠囊(R)，規格：150mg/粒，批號：03121202，江蘇揚子江藥業集團有限公司。羅紅霉素對照品含量946u/mg，批號：30351-200303，由中國藥品生物制品檢定所提供。試劑：甲醇由美國Fishers公司生產，色譜純；正己烷由德國Merck公司生產，色譜純；異戊醇以及其余試劑均為分析純，異戊醇用前經重蒸餾；水為超純水。儀器： 美國Waters公司高效液相色譜儀，包括486可變紫外檢測器，510型高壓泵，7725I型進樣閥，AS938色譜工作站；TDL40B臺式高速離心機。

1.2 受試對象 20名男性健康志愿者，年齡(24±2.8)歲，身高(173±4.9)cm，體重(64±5.8)kg。肝、腎功(GPT、GOT、BUN、CR)、心電圖、血糖、血壓、血常規試驗前檢測均正常。受試者試驗前兩周至試驗結束未服用其他藥物，受試期間忌煙、酒和含咖啡因的飲料。試驗期間統一食譜，試驗前簽署知情同意書。試驗方案獲院倫理委員會批準。

1.3 色譜條件 色譜柱：Hypersil柱(250mm×4.6mm，5μm)，美國熱電公司提供；流動相：甲醇15mmol/L磷酸二氫鉀=70∶30(氨水調pH=6)；流速：0.7mL/min；檢測波長：220nm；進樣量：50μL；柱溫：60℃。

1.4 給藥方案及血漿樣品的采集與處理 實驗采用單劑量雙周期交叉實驗設計，受試者隨機分為兩組，分別單劑量口服受試制劑和參比制劑，劑量均為每人300mg，受試者用藥前12h及用藥后4h內禁食，實驗期間統一進餐。間隔一周清洗期后再交叉。受試者于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48h取靜脈血4mL置肝素化試管中，3000r/min離心10min，分離血漿，-20℃冰箱凍存待測。 吸取血漿樣品1mL于10mL帶塞試管中，加入0.1mL 1mol/L NaOH溶液，渦旋混勻后放置5min，加入4mL正己烷與異戊醇的混合液(正己烷∶異戊醇=98∶2)，渦旋混勻2min，2500r/min離心5min，移去上層有機溶液，45℃水浴下氮氣流吹干，殘渣加100μL流動相溶解，取50μL進入HPLC分析。

1.5 數據處理 所得血藥濃度時間數據用3P97藥動學軟件計算藥動學參數，經統計矩計算得AUC0-t，AUC0-∞，MRT及t1/2。按公式t1/2=0.693/ke計算ke，Cmax和tmax為實測值，用3P97藥動學軟件進行生物等效性分析。兩制劑的AUC，Cmax 經對數轉換后進行方差分析、雙單側t檢驗，并計算90%的可信區間。tmax進行Wilcoxon檢驗。 相對生物利用度(F)=AUC試驗藥/AUC參比藥×100%

2 結果

2.1 方法的專屬性 在已建立的色譜條件下，測得空白血漿、標準血漿、受試者血漿的色譜圖。由圖1可見血漿中的內源性雜質不干擾羅紅霉素的測定。羅紅霉素的保留時間為9.5min。

2.2 標準曲線的制備及定量下限 取正常人空白血漿1mL，精密加入不同量的羅紅霉素的標準品溶液，配制質量濃度為32.06、16.03、8.02、4.01、2.01、1.00、0.50、0.25mg/L的系列標準血漿樣品，按“血漿樣品”的處理與測定方法操作。以羅紅霉素峰面積(y)對濃度(x)回歸，得標準曲線方程為：y=295.6+42874.1x，r=0.9992(n=6)，在(0.25-32.06)mg/L范圍內線性良好，羅紅霉素在血漿中的定量下限(S/N=3)為0.25mg/L，最低檢出量為12.5ng。

圖1 血漿中羅紅霉素的HPLC圖（略）

Fig.1 HPLC chromatograms of roxithromycin in human plasma

A: blank plasma; B: blank plasma with roxithromycin (4.408mg/L); C: subject plasma sample 2.0h after oral administration

2.3 回收率的考察結果 取空白血漿加入羅紅霉素對照液配成的16.548、4.408、0.547mg/L樣品各5份，按“血漿樣品”的處理與測定方法操作，測定其含量，再與加入量相比即為相對回收率。以3個濃度對應相同的進樣量的對照品進行分析，計算血漿樣品的絕對回收率，結果見表1。

表1 人血漿中羅紅霉素的回收率的測定結果（略）

Table 1 The recovery of roxithromycin in human plasma

2.4 精密度的考察結果 取空白血漿加入羅紅霉素標準液配成的16.548、4.408、0.547mg/L三個樣品各5份，按血漿樣品的處理與測定方法操作，于同日不同時間測定和不同日內重復測定，計算日內、日間精密度，結果見表2。

表2 人血漿中羅紅霉素的精密度的測定結果（略）

Table 2 The precision of roxithromycin in human plasma

2.5 血漿穩定性的考察結果 取1mL空白血漿若干份，加入羅紅霉素標準液配成的濃度為15.960、4.409、0.547mg/L的標準血漿樣品。分別對室溫放置穩定性(12h)、凍融穩定性(反復凍融2次)、長期冷凍穩定性(-20℃保存3周)以及血漿樣品處理后流動相復溶穩定性(室溫放置12h)進行考察，結果表明羅紅霉素標準血漿樣品室溫放置12h、反復凍融2次、冷凍保存3周后顯示穩定，血漿樣品處理后流動相復溶室溫放置12h顯示穩定。

2.6 羅紅霉素藥動學和生物等效性的研究 20名受試者單劑量口服羅紅霉素受試制劑或參比制劑300mg后，藥時曲線見圖2。主要藥動學參數見表3。單劑量口服羅紅霉素受試藥和參比藥的lgAUC0-∞、lgAUC0-t進行三因素方差分析，結果表明二者試驗制劑間、周期間、個體間差異均無顯著性(P>0.05)；進一步進行雙單側t檢驗及(1-2α)置信區間分析，以80%-125%為等效標準，結果判定均具有生物等效性(表4)。受試制劑的相對生物利用度F0-t為(100.3±19.1)%；F0-∞為(100.5±19.6)%。

圖2 20例志愿者服用羅紅霉素后的平均血藥質量濃度的經時曲線（略）

Fig.2 Mean plasma concentrationtime curves of roxithromycin after a single oral dose of 300mg in 20 healthy volunteers 表3 20名健康受試者口服羅紅霉素300mg后的藥動學參數（略）

Table 3 Pharmacokinetic parameters of roxithromycin after a single oral dose of 300mg in 20 healthy volunteers

表4 羅紅霉素的生物等效性分析（略）

Table 4 The bioequivalant statistical analysis of roxithromycin 3 討論 羅紅霉素的測定方法有抗生素微生物檢定法[13]、HPLCCED法[45]、HPLCMS法[67]和HPLCUV法[810]。HPLCUV法具有定量快速、精確的特點，方法明顯優于微生物效價測定法。本試驗采用了反相高效液相法測定血漿中的羅紅霉素的濃度，具有較高的選擇性。此方法專屬性強，精密度、靈敏度較好，能夠滿足該藥的藥動學研究的要求。用二氯甲烷或乙醚作為萃取溶媒回收率低，乙醚提取雜質成分較多。在測定血漿羅紅霉素濃度的文獻[9]中，樣品預處理用特殊的固相提取柱提取，其方法操作極其復雜。根據Macek[10]的方法，本文用己烷異戊醇(98∶2)的液液萃取方法提高了回收率，改進了樣品提取純化效果。在220nm波長處檢測羅紅霉素無雜質干擾峰。 20名健康受試者的自身對照試驗表明，受試藥羅紅霉素膠囊和參比藥羅紅霉素膠囊在健康人體內的過程基本一致，其主要藥動學參數相近，具有生物等效性。受試者在試驗過程中未發現嚴重的不良反應。