作者：郭東艷 陳士林 楊大堅

【摘要】 目的比較葛根素衍生物4ac混懸液及其納米粒在Beagle犬體內(nèi)的生物利用度。方法分別于給藥后不同時間取血，高效液相色譜（HPLC）法測定血清中葛根素衍生物4ac的血藥濃度，應(yīng)用3P97藥動學(xué)統(tǒng)計軟件對血藥濃度數(shù)據(jù)擬合。結(jié)果葛根素衍生物4ac混懸液及其納米粒在Beagle犬體內(nèi)過程均符合二室開放模型。結(jié)論葛根素衍生物4ac納米粒較葛根素衍生物4ac混懸液相比能明顯提高在Beagle犬體內(nèi)的生物利用度。

【關(guān)鍵詞】 葛根素衍生物4ac； 藥物動力學(xué)； 高效液相色譜

Abstract：ObjectiveTo study the pharmacokinetics of suspension and nanopaticles in beagle dogs.MethodsBlood was collected at different time. The plasma concentration of the derivatives-4ac was determined by HPLC. The compartment model was calculated with 3p97 program and the pharmacokinetic parameters were compared with SPSS program. ResultsThe suspension and nanopaticles of derivatives-4ac could be fitted to two-compartment model in beagle dogs. ConclusionNanopaticle of derivatives-4ac can obviously improve the bioavailability in beagle dogs.

Key words：Derivatives-4ac； Pharmacokinetics ； HPLC 葛根素是葛根心腦血管活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［1，2］，臨床上常用于治療冠心病、心絞痛及腦血栓等疾病［3～5］。實驗證明，犬口服葛根素的生物利用度低，其絕對生物利用度約為3%，大部分以原形從糞便中排出。為了提高葛根素的生物利用度，制備了葛根素的衍生物4ac及其衍生物4ac的納米粒。本實驗旨在采用高效液相色譜法，測定葛根素衍生物4ac混懸液及其納米粒在Beagle犬體內(nèi)的生物利用度。

1 器材

1.1 藥品與試劑葛根素衍生物4ac由香港理工大學(xué)楊大堅教授提供，經(jīng)HPLC法測定含量均在98%以上。葛根素衍生物4ac混懸液為4ac加蒸餾水制成的混懸型水針劑；葛根素衍生物4ac納米粒凍干針劑（4ac-PLA-NP，香港理工大學(xué)中藥研究所自制）為衍生物4ac經(jīng)溶劑揮發(fā)法制備的納米膠體溶液經(jīng)冷凍干燥制成的凍干粉針劑。 乙腈、甲醇均為HPLC級，水為重蒸餾水。

1.2 儀器與色譜條件Agillent1100高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器，HP1100色譜工作站；Agillent XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；預(yù)柱為Agillent XDB-C18柱（4.6 mm×12.5 mm ，5 μm）；梯度洗脫：0 min 乙腈∶水（10∶90） 0.7ml/min；15 min乙腈：水（60∶40）0.7 ml/min；20 min 乙腈∶水（70∶30） 0.7 ml/min；30 min 乙腈∶水（100∶0） 0.7 ml/min；柱溫為室溫；檢測波長為250 nm。

1.3 動物Beagle犬，體重（10±0.1）kg，雌雄兼用，由廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院Beagle犬培育中心供應(yīng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素衍生物4ac納米粒（4ac-PLA-NP)的制備稱取聚乳酸100 mg，4ac30 mg，卵磷脂0.2 ml（預(yù)先用二氯甲烷配成25％的溶液），加入1 ml二氯甲烷中溶解，作為有機相；另取普流羅尼克68（F-68）300 mg溶于蒸餾水中，作為連續(xù)相；將有機相加入連續(xù)相中，攪拌除去有機溶劑即得。

2.2 樣品采集取Beagle犬6只，隨機分為兩組，每組3只，實驗前禁食12 h， 4ac混懸水針劑、4ac-PLA-NP凍干針劑分別按含4ac 6 mg/kg靜脈注射給藥，于給藥后0，0.083，0.25，0.5，1.0，3.0，6.0，12，24， 48，72，96，144 h取血，靜置30 min后離心，取上層血清備用。

2.3 樣品處理精密吸取0.5 ml血清，加入甲醇2.0 ml，旋渦振蕩1 min，離心15 min（3 000 r/min），上清液用氮氣流吹干，殘渣加0.2 ml甲醇溶解，離心10 min（10 000 r/min），取上清液進樣。

2.3.1 色譜條件葛根素對照品液、空白血清、含藥血清經(jīng)處理后的溶液的HPLC色譜圖見圖1～3。由圖可見血清中內(nèi)源性雜質(zhì)對葛根素的測定無干擾，葛根素的保留時間為8.3 min。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備稱取葛根素對照品適量，用甲醇溶解，制成每毫升約含0.1 mg的溶液，作為貯備液。精密吸取此貯備液用甲醇稀釋為含葛根素為18.75，12.5，9.375，6.25，3.125 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取以上標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 ml，加入空白血清0.5 ml，按樣品處理方法進行處理，得一系列對照品溶液。分別吸取以上系列對照品溶液20 μl，進樣測定峰面積。以葛根素濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得葛根素對照品在血液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A=149 750C-55.665 （r=0.996 3），在0.156 3 ～0.937 5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由于回歸方程中b/a＞＞100，因此采用外標(biāo)一點法定量。

2.3.3 回收率實驗取0.5 ml空白血清6份，分別加入不同量的葛根素對照品溶液，旋渦混合均勻，分別加入甲醇2.0 ml，旋渦振蕩1 min，離心15 min，3 000 r/min，上清液用氮氣流吹干，殘渣加0.2 ml甲醇溶解，離心10 min，10 000 r/min，取上清液進樣。記錄峰面積，求回收率。高、中、低濃度的平均回收率為96.58%。結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗（略）

結(jié)果表明，回收率在要求范圍內(nèi)， 該方法合理、可行。

2.3.4 精密度實驗取含葛根素的血清樣品0.5 ml，加入甲醇2.0 ml，旋渦振蕩1 min，離心15 min（3 000 r/min），上清液用氮氣流吹干，殘渣加0.2 ml甲醇溶解，離心10 min（10 000 r/min），取上清液進樣。采用外標(biāo)一點法計算，求RSD（％）。結(jié)果見表2～3。

表2 日內(nèi)精密度（略）

表3 日間精密度（略）

結(jié)果表明，日內(nèi)及日間精密度均<10%，該方法的精密度良好。

2.4 數(shù)據(jù)分析按“2.3”樣品處理方法項下對各樣品進行處理，進樣，采用外標(biāo)一點法計算出各樣品的血藥濃度，將測得的血藥數(shù)據(jù)輸入計算機，用3P97藥動學(xué)統(tǒng)計程序處理，結(jié)果表明游離4ac及其納米粒的體內(nèi)過程均符合二室開放模型。其主要藥動學(xué)參數(shù)見表4。

表4 4ac混懸液及其納米粒主要藥動學(xué)參數(shù)（略）

從表4數(shù)據(jù)直觀來看，納米粒在體內(nèi)血藥濃度與時間曲線下的面積遠遠高于4ac混懸液組，經(jīng)t檢驗， 4ac混懸液與納米粒組比較有極顯著性差異（t<0.01）。

圖1 空白血清色譜圖（略）

圖2 血液樣品色譜圖（略）

圖3 葛根素色譜圖（略）

3 討論 在進行含量測定中發(fā)現(xiàn)，血清樣品中，4ac在Beagle犬體內(nèi)主要以葛根素的形式存在，分析其原因可能是由于衍生物在犬體內(nèi)水解，脫乙酰基而成為葛根素的緣故。因此，含量測定中采用葛根素為對照品進行含量測定。 由于葛根素衍生物4ac的脂溶性較強，制備成注射液時需要大量的增溶劑；為此制備了葛根素衍生物4ac的納米粒，旨在提高其生物利用度，通過Beagle犬體內(nèi)的生物利用度比較實驗可以看出，制成納米粒后其生物利用度明顯提高。分析其主要原因在于消除半衰期明顯延長，增加了藥物在體內(nèi)吸收的緣故。

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