【摘要】 目的 探討羧甲基茯苓多糖的制備方法及其抗腫瘤活性。方法 在鹵代酸存在下一步法簡便制備羧甲基茯苓多糖，并分別研究其體內、體外抗腫瘤活性。結果 同對照組相比，羧甲基茯苓多糖在抑制昆明種小鼠H22肝癌細胞及小鼠腫瘤U14 細胞活性方面具有顯著效果。結論 通過簡便方法制備得到了可顯著提高荷瘤小鼠免疫力的羧甲基茯苓多糖，適當劑量的羧甲基茯苓多糖具有良好的抗腫瘤活性。

【關鍵詞】 羧甲基茯苓多糖 制備 抗腫瘤活性

【Abstract】 Objective To study the preparation and the antitumor effects of carboxymethyl pachyman.Methods Carboxymethyl pachmaran was prepared conveniently in onestep process with the presence of halogenated acid. The antitumor effects of carboxymethyl pachmaran in vivo and in vitro were studied respectively.Results There were significant effect of the carboxymethyl pachyman for inhibition on murine 22 hepatocarcinoma cell and murine U14 Cancer Cells comparing with control group.Conclusion Carboxymethyl pachyman can be prepared conveniently. Proper dose of carboxymethyl pachyman has a good antitumor effect. 【Key words】 carboxymethyl pachyman；preparation；antitumor effect

茯苓為常用中藥，亦屬于壯藥的一種，最早見于唐代《新修本草》：“…今調營而理胃，上品仙藥也。善能斷谷不饑，為藥無朽蛀…”(卷十二)［1］，為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，具有健脾利術，寧心安神等功效。茯苓菌核中的β茯苓多糖約占茯苓菌核干重93％，具有多種生理活性［2］，但茯苓多糖不溶于水，不便于臨床應用，抗腫瘤活性也不顯著。將茯苓多糖羧甲基化可得到具有強抗腫瘤活性的水溶性多糖：羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl pachymaran，簡稱CMP)，研究發現，羧甲基茯苓多糖能直接抑制腫瘤細胞的生長，顯著減輕惡性腫瘤患者化療、放療的毒副反應，并且能使患者的免疫功能得到很大程度的改善［3］。本文報道一種較為簡便的CMP制備方法，并分別從體內、體外兩個角度研究其抗腫瘤活性。

材料與方法 1.材料

（1）實驗動物

清潔級ICR/JCL品系小鼠由中科院廣州生物醫藥與健康研究院實驗動物中心提供，昆明種小鼠由中山大學實驗動物中心提供。

（2）實驗藥品

羧甲基茯苓多糖由自制白茯苓合成，白茯苓制法：茯苓采至廣西百色市樂業縣山區，將采集的鮮茯苓經去雜去沙→分等→發汗→剝皮→切制(白、赤分開)→日曬至六成干→回潤→日曬或烘至全干等工藝制得。二氯乙酸、異丙醇、氫氧化鈉等均為分析純，購自上海化學試劑公司。

（3）主要儀器 干燥箱，分析天平，100目篩；Thermo Forma 3110二氧化碳培養箱，2010型酶標儀（ELISA Reader 2010），SCWCJ超凈工作臺，CK4032NFL熒光倒置顯微鏡等。

2.方法

（1）羧甲基茯苓多糖的簡便制備

取自制白茯苓（去皮茯苓菌核）進一步烘干（95℃左右），粉碎，過100目篩備用；稱取上述制備的25 g茯苓粉，加入至100 ml異丙醇溶劑中，加入1%氫氧化鈉溶液50 ml，攪拌使堿液溶解后，在快速攪拌條件下，通過真空滴液漏斗滴入二氯乙酸的異丙醇溶液(1∶1.2，50 ml)，控制溫度在50℃攪拌反應3.5小時。反應結束后將上層異丙醇傾出并回收利用，下層加入5%鹽酸溶液，快速攪拌下加入乙醇50 ml， 過濾，固體物部分溶解于水中，用乙醇沉淀，過濾，干燥，得白色粉末狀固體，即羧甲基茯苓多糖。波譜數據：羧甲基茯苓多糖：1H NMR(400 MHz)δ:3.3 (s， 質子堆積峰);IR (CH2Cl2): 1582（─COO-吸收峰），1345（─CH2─峰），885（弱β吡喃吸收峰）cm-1。 配制8 mg/ml羧甲基茯苓多糖待用。

（2）體內抗腫瘤實驗

CMP溶液抑制小鼠腫瘤U14實驗：先將48只20 g ICR/JCL品系小鼠右前肢液部用碘酒、酒精作表面消毒，然后將0.3 ml的小鼠U14 腹水型瘤細胞毒（3.3×106個）注射入皮下，接種后飼養7天，逐只檢查小鼠接種部位的瘤細胞生長情況，選出可以觸摸到腫塊的小鼠，隨即分成6組，每組8只。從第八天起，實驗組小鼠每天分別按30，60，120，180，240，360 mg/kg等6種不同劑量腹腔注射給藥1次，對照組每只小鼠每天腹腔注射等體積生理鹽水一次，各組連續給藥10天，停藥后再繼續飼養7天，然后將各組小鼠頸椎脫臼處死，直到完整剝離出瘤體，稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=(對照組瘤體稱重-CMP組瘤體稱重）÷對照組瘤體稱重×100%。

CMP溶液抑制昆明種的小鼠H22肝癌細胞實驗：5個實驗組（每組均90 ml）的細胞培養液中分別預加入CMP 20 μg，40 μg，200 μg，500 μg和1 mg，對照組的細胞培養液（90 ml）不加入CMP。取接種7天生長良好的腹水型帶H22肝癌的小鼠，頸椎脫臼處死，取腹水，用生理鹽水稀釋成每毫升1×106個癌細胞的懸液，然后在實驗組、對照組的細胞培養液中分別加入10 ml癌細胞懸液(每毫升含1×106個癌細胞)，各組混勻，于37℃共培養24小時，采用MTT法觀察CMP對小鼠H22肝癌細胞生長的影響。OD值由下述公式計算：OD=C×D×E= 1og(1/T)，C為檢測物的濃度，D為檢測物的厚度，E為摩爾因子，T為檢測物的透光值。 3.統計學處理

計量資料以-±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統計學差異。

結 果

1.體內抗腫瘤作用

實驗結果表明，CMP30～360 mg/kg劑量腹腔注射，對ICR/JCL品系的小鼠腫瘤U14 有較強的抑制作用，對比實驗發現CMP最優注射劑量為180 mg/kg。見表1。表1 CMP腹腔注射對小鼠腫瘤U14 的抑制作用(略)注：與對照組比較，▲P＜0.01 2.體外抗腫瘤作用 體外實驗研究表明，0.2～10μg/ml濃度的CMP對小鼠H22肝癌細胞的生長有較顯著抑制作用，其中以CMP 2.0 μg/ml為最優濃度。見表2。表2 CMP對小鼠H22肝癌細胞生長的抑制作用(略)注：與對照組比較，▲P＜0.01

討 論

1.羧甲基茯苓多糖的制備

羧甲基茯苓多糖的制備方法主要有水媒法和溶媒法兩種［4］。水媒法是把初步制得的茯苓多糖用稀堿溶液溶解，再加入一定量的鹵代酸水溶液，適當溫度下進行醚化反應；溶媒法則是把茯苓多糖懸浮在有機溶劑(如二甲苯、氯仿、乙醇等)中，堿化一段時間，再加入鹵代酸，在適當溫度下進行醚化反應，使鹵代酸中-CH2COOH結構取代多糖分子上的OH中的H，取代程度越高，羧甲基茯苓多糖收率也越高。第一種方法加酸中和后，多糖在介質中呈黏稠的凝胨狀，分離難度很大，使CMP分離產率顯著降低；第二種方法有機溶劑消耗量大，成本高。本研究選用自制茯苓粉在異丙醇溶劑中高效合成羧甲基茯苓多糖，并通過工藝優化試驗，使其消耗水和有機溶劑盡可能少，反應操作簡便，羧甲基取代度高，產品水溶性好，臨床應用效果顯著。

2.抗腫瘤實驗

癌癥為世界醫學極為關注的難題，世界各國均高度重視，各種治療、預防措施正加緊研究。茯苓具有特有的藥理、藥化作用，其抗腫瘤效應亦日趨引起人們的重視。由于茯苓多糖分子中主要為β－1→6葡萄糖結構，糖鏈上分布有少量的β－1→6結構的葡萄糖側鏈。未經化學改造的茯苓多糖對腫瘤的抑制率僅為 0～3％。本實驗采用化學修飾方法將茯苓多糖中的β－1→6側鏈切斷，經過適度水解得到線型的β－1→3茯苓次多糖，在鹵代酸存在下將其羧甲基化，即可得到有較高抗腫瘤活性的羧甲基茯苓多糖。 體內實驗結果表明，CMP 30～360 mg/kg劑量腹腔注射，對ICR/JCL品系的小鼠腫瘤U14有較強的抑制作用，當注射劑量為30 mg/kg時，抑瘤率為68.7%，隨著劑量的增大，抑瘤率逐漸升高，當注射劑量為60 mg/kg時，抑瘤率升至77.2%，而注射劑量升至180 mg/kg時，抑瘤率可高達92.2%。但注射劑量再進一步升高對提高抑瘤率并無幫助，相反，隨著注射劑量加大，抑瘤率有一定程度降低，如當注射劑量為360 mg/kg時，抑瘤率反倒下降為89.1%。因此，本抑瘤實驗中，CMP最優注射劑量應為180 mg/kg。體外實驗研究表明，0.2～10 μg/ml濃度的CMP對小鼠H22肝癌細胞的生長有較顯著抑制作用。如當CMP濃度為0.4 μg/ml時，12小時和24小時OD值分別為0.8212±0.081 和1.473±0.081，較對照組顯著降低（P均＜0.01），CMP 2.0 μg/ml為最優濃度，濃度更高將導致OD值進一步升高。