【關(guān)鍵詞】 燈盞花顆粒 血小板聚集 血栓形成 腦血流量

Pharmacokinetic experiment of Erigeron breviscapus pellets

【Abstract】 Objective The arteria carotis externa was ligated， and arteria carotis interna was kept opening The left carotid artery was exposed and placed over an ultrasonic flow probe. The brain flow volume was recorded with an ultrasonic volume meter. The pursiness time of mice was observed to evaluate the effect of Erigeron breviscapus pellets on cerebral ischemia. Methods Born’s method was used to investigate effects of Erigeron breviscapus pellets on rabbit platelet aggregation induced by adenosine diphosphate (ADP)， arachidonic acid (AA)， and platelet-activating factor (PAF)， in vitro or in vivo. Antithrombotic effects of Erigeron breviscapus pellets was monitored according to Peter’s method. Results The results showed that Erigeron breviscapus pellets significantly increased brain blood flow and prolonged mouse pursiness time; Erigeron breviscapus pellets markedly inhibited ADP-， AA-， or PAF-induced platelet aggregation in vitro or in vivo， and prolonged the occlusion time of electrically-stimulated carotid artery.Conclusion It is suggested that Erigeron breviscapus pellets improved cerebral ischemia and hypoxia due to its antiplatelet and antithrombotic effects. It is obviously advantageous to protect ischemic brain tissue.

【Key words】 erigeron breviscapus pellets platelet aggregation thrombosis brain blood flow

血小板聚集性增高在血栓栓塞性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［1］。燈盞花［Erigeron breviscapus (Vant.)Hand.-Mazz］是云南省特有的民族藥用植物， 民間主要用其防治中風(fēng)偏癱等疾病。燈盞花顆粒的主要有效組分是燈盞花總黃酮 (Erigeron reviscapus flavones)， 主要成份有燈盞花素、芹菜素、4′-羥基黃芩素等［2］。燈盞花顆粒臨床主要用于防治缺血性 (或血栓栓塞性) 腦血管疾病。多年臨床實(shí)踐證明，燈盞花顆粒對(duì)腦缺血、腦血栓病等血淤性疾病療效甚好。為進(jìn)一步保護(hù)該產(chǎn)品，本試驗(yàn)著重研究燈盞花顆粒對(duì)大鼠腦血流量、小鼠斷頭喘氣時(shí)間的影響，同時(shí)測(cè)定燈盞花顆粒的抗血小板及抗血栓形成作用，以期為進(jìn)一步保護(hù)和利用該產(chǎn)品提供藥效學(xué)試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 ICR小鼠及雄性SD大鼠，由云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物室提供（滇實(shí)動(dòng)證字第9806、9805號(hào)）；健康家兔，體重2～2.5kg，雌雄均用，均由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供 (滇實(shí)動(dòng)證字第2002082號(hào))。

1.2 藥物及試劑 燈盞花顆粒，規(guī)格：5g/包(0.6g浸膏/包)；試驗(yàn)用藥料浸膏，1g浸膏等于4g生藥，批號(hào)：

20010704，由云南植物藥業(yè)有限公司提供。復(fù)方丹參滴丸，規(guī)格：0.25g/粒，批準(zhǔn)文號(hào)：(95)衛(wèi)藥準(zhǔn)字Z-01號(hào)，批號(hào)：20010117，由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)。花生四烯酸(arachidonic acid， AA) 和血小板活化因子(platelet activator factor， PAF) 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，臨用前分別用 100mmol/L的 Na2CO3溶液及含0.25%小牛血清蛋白的Tris-NaCl緩沖液稀釋。腺苷二磷酸 (adenosine diphosphate，ADP) 系 Fluka 公司產(chǎn)品，以磷酸鹽緩沖液溶解備用。

1.3 儀器 SEN-7203型電刺激儀，日本Nihon Kohden公司產(chǎn)品；DVM -4200型二道血流速度流量?jī)x，日本Hayashi Denki公司生產(chǎn)；LBY-NJ2 型血液凝聚儀， 由北京普利生精密儀器研究中心生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠腦血流量的影響［3］ 雄性SD大鼠，體重180～220g，隨機(jī)分為5組，每組8只，即等體積生理鹽水組、187.5、375、750mg/kg的燈盞花顆粒組和375mg/kg 的復(fù)方丹參滴丸組。大鼠以30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，分離頸總動(dòng)脈并結(jié)扎頸外動(dòng)脈；打開腹腔，找出十二指腸。用二道血流速度流量?jī)x超聲探頭于近頭端測(cè)定正常的頸總動(dòng)脈血流量(此時(shí)，頸總動(dòng)脈的血流量主要反應(yīng)腦血流量)，待平穩(wěn)后，經(jīng)十二指腸分別給予上述藥物，30min后，同上測(cè)量頸總動(dòng)脈血流量，觀察藥物對(duì)大鼠腦血流量的影響。

結(jié)果表明，高、中劑量的燈盞花顆粒及375mg/kg的復(fù)方丹參滴丸均明顯增加大鼠腦血流量，見表1。

2.2 對(duì)小鼠斷頭后張口喘氣時(shí)間的影響［3］ 體重18～22g的ICR小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，每組10只，即等體積的生理鹽水組、187.5、375、750mg/kg的燈盞花顆粒組和375mg/kg復(fù)方丹參滴丸組。實(shí)驗(yàn)組按0.2ml/10g灌胃給藥，每日1次，連續(xù)5天。于末次給藥后1h，將小鼠逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后張口喘氣停止時(shí)間作為抗腦缺血指標(biāo)，數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié)果顯示，高、中劑量的燈盞花顆粒及復(fù)方丹參滴丸均明顯延長(zhǎng)正常小鼠斷頭張口喘氣時(shí)間，見表2。

2.3 對(duì)家兔血小板聚集功能的影響

2.3.1 富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP) 和貧血小板血漿(platelet-poor plasma， PPP)的制備自清醒家兔頸動(dòng)脈取血收集于塑料離心管中，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑體積比9:1)。于室溫下1000r/min離心10min，得PRP，吸出PRP于潔凈塑料管中;剩余血液再以3000r/min離心10min得PPP。PPP用于調(diào)零或調(diào)整PRP中的血小板數(shù)目，試驗(yàn)過程中血小板數(shù)控制在5×1011cell/L。

2.3.2 血小板聚集性測(cè)定 體外試驗(yàn)：將供試品用生理鹽水溶解并稀釋成不同濃度的藥液備用，分別取10μl藥液或生理鹽水于PRP中，37℃溫育10min。按Born氏比濁法［4］，即PPP調(diào)零及PRP調(diào)幅后，分別加入5μl的AA(終濃度0.35mmol/L)，ADP(3μmol/L)或PAF(7.2nmol/L)，在血小板聚集儀上測(cè)定血小板聚集性并記錄5min內(nèi)血小板最大聚集率，血小板聚集抑制率按下式計(jì)算:

血小板聚集抑制率(%)=［1-(給藥管聚集百分率/對(duì)照管聚集百分率)］×100

用直線回歸法求出藥物的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration， IC50)

結(jié)果表明，燈盞花顆粒顯著抑制AA、ADP或PAF誘導(dǎo)的血小板聚集，并呈濃度依賴關(guān)系，其IC50分別為1.81，3.97和4.93g/L；復(fù)方丹參滴丸對(duì)ADP及PAF誘導(dǎo)的血小板聚集均呈濃度依賴性明顯抑制作用，其IC50分別為0.96和4.2g/L，對(duì)AA誘導(dǎo)的血小板聚集抑制作用稍弱，求不出IC50，見表3。

體內(nèi)試驗(yàn)：家兔隨機(jī)分成5組，每組5只，即等體積生理鹽水組、187.5、375、750mg/kg的燈盞花顆粒組和375mg/kg的復(fù)方丹參滴丸組。上述各組份均以5ml體重灌胃。給藥前取血一次，給藥后0.5、1、2、3和4h分別取血，同體外試驗(yàn)方法制備PRP和PPP，觀察藥物灌胃后對(duì)AA、ADP和PAF誘導(dǎo)的血小板聚集功能的影響。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，燈盞花顆粒灌胃后均具有明顯抑制血小板聚集作用。表現(xiàn)為，對(duì)AA誘導(dǎo)的聚集:187.5mg/kg時(shí)無明顯抑制血小板聚集，375和750mg/kg劑量灌胃后1h起效，于3h達(dá)最大效應(yīng)，藥效至少可持續(xù)4h；復(fù)方丹參滴丸于給藥后2h起效，藥效可持續(xù)4h；對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集：187.5mg/kg的燈盞花顆粒于給藥后2h起效，可持續(xù)4h，當(dāng)劑量增大至375和750mg/kg時(shí)，于灌胃后1h起效，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板聚集率不斷下降；對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集：三種劑量的燈盞花顆粒均于給藥后1h產(chǎn)生抑制血小板聚集作用，3、4h達(dá)最大抑制作用，而375mg/kg的復(fù)方丹參滴丸只是于給藥后3h會(huì)有一過性的降低血小板聚集率作用，見表4。

注：n=5，與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01

注：n=5，與給藥前(0h)比較*P<0.05，**P<0.01

2.3.3 對(duì)電刺激大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響［5］ 雄性SD大鼠，250～300g，隨機(jī)分5組，每組6只，即等體積生理鹽水組、187.5、375、750mg/kg的燈盞花顆粒組和375mg/kg的復(fù)方丹參滴丸組。各組動(dòng)物均以1ml/100g體重一次性灌胃，給藥45min后用戊巴比妥鈉以30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，然后分離左頸總動(dòng)脈，測(cè)定正常的血流量，然后放置兩根銀制電極于血管兩端，通以直流電刺激，并調(diào)電流1.5mA，連續(xù)刺激7min，同時(shí)于近頭端測(cè)量血流量。從刺激開始至血流量為零的時(shí)間為血栓形成時(shí)間(occlusion time，OT)。

結(jié)果表明，高、中劑量的燈盞花顆粒及復(fù)方丹參滴丸均明顯延長(zhǎng)電刺激大鼠頸動(dòng)脈的血栓形成時(shí)間，見表5。

3 討論

針對(duì)云南植物藥業(yè)有限公司研制的燈盞花顆粒的主要臨床運(yùn)用，本試驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：血小板在不同誘導(dǎo)劑的作用下發(fā)生不同的活化反應(yīng)。根據(jù)活化反應(yīng)的強(qiáng)弱，可將誘導(dǎo)劑區(qū)分為弱誘導(dǎo)劑如ADP，強(qiáng)誘導(dǎo)劑如PAF，AA則介于其中間［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明燈盞花顆粒在體內(nèi)外均明顯抑制ADP、AA和PAF引起的血小板聚集，并與濃度(劑量)呈正相關(guān)性，提示燈盞花顆粒表現(xiàn)為非選擇性的抑制血小板活化反應(yīng)。目前公認(rèn)，血小板活化有ADP、AA和PAF三條途徑［7］，但最終通過降低血小板內(nèi)cAMP水平并增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度而引起血小板活化聚集［8］。燈盞花顆粒對(duì)這三條途徑均有抑制作用，因此不可能作用于某一誘導(dǎo)劑的特異受體，而以通過某一共同環(huán)節(jié)抑制血小板活化最為可能。大多數(shù)黃酮類化合物(包括燈盞甲素和乙素)抑制cAMP-磷酸二酯酶(PDE)，而升高cAMP含量［9］，我們推測(cè)燈盞花顆粒的作用可能是由于抑制PDE，升高血小板內(nèi)cAMP，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低，從而產(chǎn)生抑制血小板聚集作用。

電刺激大鼠頸動(dòng)脈所形成的血栓與人體動(dòng)脈血栓相似。采用血流量?jī)x替代點(diǎn)式溫度計(jì)來判斷OT，則排除了室溫的影響，其結(jié)果更精確可靠。燈盞花顆粒明顯延長(zhǎng)動(dòng)脈OT，表明燈盞花顆粒具有較強(qiáng)的抗動(dòng)脈血栓形成作用，明顯抑制血小板聚集功能是其抗血栓形成的機(jī)制之一。

燈盞花顆粒在體內(nèi)外均明顯抑制AA、ADP及PAF誘導(dǎo)的血小板聚集作用，同時(shí)還顯著減少電刺激大鼠頸動(dòng)脈血栓形成作用，提示燈盞花顆粒具有明顯的活血化瘀及通脈作用。

在結(jié)扎頸外動(dòng)脈的條件下，用二道血流速度流量?jī)x超聲探頭于近頭端測(cè)定正常的頸總動(dòng)脈血流量，此時(shí)，頸總動(dòng)脈的血流量主要反應(yīng)腦血流量。燈盞花顆粒可明顯增加大鼠腦血流量，提示燈盞花顆粒具有增加腦組織血供作用。燈盞花顆粒能明顯延長(zhǎng)小鼠斷頭后喘氣時(shí)間，提示本品具有抗腦組織的缺血、缺氧作用。

綜上所述，云南植物藥業(yè)有限公司研制的燈盞花顆粒具有顯著的通脈及改善腦組織的缺血和缺氧作用，對(duì)缺血性腦組織具有明顯的保護(hù)作用。本試驗(yàn)為燈盞花顆粒的臨床應(yīng)用提供了藥效學(xué)試驗(yàn)依據(jù)。

1 國(guó)家醫(yī)藥管理局中藥情報(bào)中心站.植物藥有效成份手冊(cè).第二版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986，946. 2 Ogletree ML.Overview of physiological and pathophysiological effects of thromboxane A2.Fed Proc， 1987，46:133. 3 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1993，538，783-785. 4 Born GVR. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature， 1962，194：927. 5 Peter AC， Richard WF， Fiona B，et al. Evaluation of a low molecular weight modulator of human plasminogen activator inhibitor-1 activity. Thrombosis and Haemostasis， 1996， 75: 808. 6 Colman RW. Evaluation for potency of platelet inducers. Thrombosis and Haemostasis， 1982， 390. 7 Vermylen J， Badenhorst PN， Deckmyn H， et al. Normal mechanisms of platelet function. Clinics in Haematology， 1983， 12: 107. 8 Vargaftig BB， Chignard M， Benveniste J. Present concepts on the mechanisms of platelet aggregation. Biochem Pharmacol， 1981， 30: 363. 9 賀師鵬.黃酮類化合物抗血小板活化機(jī)制研究.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 1982， 14: 253.