作者：瑪依努爾·艾力，哈木拉提·吾甫爾，阿不力孜，伊力哈木

【摘要】 目的 研究異常黑膽質成熟劑總黃酮對肝癌Bel/Fu細胞株多藥耐藥性(MDR)及mRNA表達的影響。方法 逆轉錄聚合酶鏈式反應法檢測細胞內MDR1、MRP、GST-π、TopoⅡα mRNA的表達。結果 異常黑膽質成熟劑總黃酮可抑制人肝癌Bel/Fu細胞株MDR1 mRNA的表達，提高TopoⅡαmRNA水平。結論 異常黑膽質成熟劑總黃酮抑制MDR1 mRNA的表達、提高TopoⅡαmRNA水平是其逆轉肝癌MDR的機制。

【關鍵詞】 維藥；Bel/Fu細胞株；多藥耐藥性；逆轉錄聚合酶鏈式反應法；異常黑膽質成熟劑總黃酮 Abstract：Objective To study the effect of Abnormal Savda Munziq (ASMq) on MDR and expression of mRNA of Bel/Fu cell line. Methods Several genes expression including MDR1， MRP， TOPOIIα and GST-π were analyzed by RT-PCR. Results ASMq has been found to down-regulate MDR1 gene and simultaneously up-regulate TopoⅡαmRNA. Conclusion ASMq can reverse the drug resistance against 5-Fu in Bel/Fu cells. Inhibition of MDR1 mRNA and up-regulate TopoⅡα mRNA may contribute to the mechanisms. Key words：Uighur medicine；Bel/Fu cell line；MDR；RT-PCR；ASMq 本實驗選用肝癌耐藥細胞株Bel/Fu作為研究對象，對維藥異常黑膽質成熟劑總黃酮(ASMq)逆轉肝癌多藥耐藥性(MDR)與相關分子機制進行了研究，旨在尋找一種新型具有MDR逆轉作用的藥物。

1 實驗材料

9700型PCR擴增儀；Kodak凝膠電泳成像分析系統(EDAS)；肝癌細胞株Bel/Fu(南京凱基生物公司產品)；ASMq，新疆維吾爾醫研究所提供；5-氟尿嘧啶(5-Fu)，揚州奧賽康藥業有限公司產品；逆轉錄酶AMV(Gibco/BRL公司)；Tripure試劑(Gibco/BRL公司)；Taq酶(寶泰克公司)；特異性引物(Takara公司合成)。

2 實驗方法

2.1 MTT法測定細胞毒 用0.25%胰酶消化處理對數生長期細胞，用含質量分數為10%胎牛血清的RPMI-1640培養液配成密度為3×103個細胞/mL單細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔體積200 μL，待細胞貼壁后，分成5組。ASMq組加5 μL ASMq，其濃度為300、320、340、350、360、380、390、400、460 μg/mL；ASMq＋5-Fu組，在ASMq組的基礎上加入5 μL 5-Fu(濃度為0.02 μg/mL)；細胞對照組不加藥物；5-Fu組每孔僅加入5 μL 5-Fu(濃度為0.02 μg/mL)；空白組于37 ℃體積分數為5%的CO2中培養4 d后，向每孔加入50 μL MTT(1mg/mL)，繼續培養4 h，移去上清后，每孔再加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，用酶標儀測定OD570 nm 值。用下式計算細胞存活率及逆轉倍數。

細胞存活率(%)＝ 劑量組OD490平均值－空白組OD490平均值 陰性對照組OD490平均值－空白組OD490平均值

逆轉倍數＝逆轉劑加抗癌藥物組細胞死亡率抗癌藥物組細胞死亡率

2.2 藥物聯合應用評價

2.3 RT-PCR測定MDR相關基因 將Bel/Fu細胞置于含10%的小牛血清RPMI-1640中，于37 ℃的體積分數為5%的CO2環境中培養，細胞密度為3×104 個/mL。分為Bel27402細胞對照組；Bel/Fu細胞＋390 μg/mL AsMq用藥組，分別于24、48、72、96 h測定細胞MDR相關基因表達。應用Trizol體系提取RNA，RT-PCR實驗按常規方法進行，cDNA在－20 ℃保存備用。 PCR分析：MDR1、MRP、GST-π、TopoⅡα引物及內對照物β-actin見表1。反應條件：于94 ℃進行3 min預變性，于94 ℃進行30 s 變性，于57 ℃進行45 s退火，于72 ℃延伸1 min，再于72 ℃延伸10 min 并循環30 次，用質量分數為115%的瓊脂糖進行凝膠電泳分析并照像。利用凝膠電泳成像分析系統對擴增帶進行強度分析，分別計算每條泳道的MDR1、MRP、GST-π、TopoⅡα、β-actin的總強度比值，用來表示樣品中MDR1、MRP、GST-π、TopoⅡα mRNA的水平。表1 引物序列和擴增產物長度（略）

3 結果

(見表2、表3)表2 不同濃度ASMp對Bel/Fu細胞MDR逆轉效應(略)注：與細胞對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與ASMq組比較，#P<0.01。 表3 ASMp對MDR相關基因的影響(略)注：與細胞對照組同一時間段比較，*P<0.01。

4 討論

維吾爾醫藥學是中醫學的重要組成部分，它是維吾爾人民與疾病不斷作斗爭而建立的醫學體系，具有豐富的臨床實踐和獨特的理論內涵。尤其是對腫瘤等難治性疾病具有獨特的認識和有效的療法，其中不乏治療癌癥的有效處方和用藥，異常黑膽質成熟劑就是其典型的代表。

ASMq對肝癌HepG2細胞體外生長、凋亡及相關基因調控的研究中發現，ASMq可以濃度依賴性地抑制抗凋亡基因Bcl-2表達，促進促凋亡基因p53、p21、Bax表達水平。因此，認為抑制癌細胞生長、引起DNA鏈斷裂、誘導癌細胞凋亡、調節凋亡相關的Bcl-2、p53、p21、Bax等基因mRNA表達水平等，可能是ASMq發揮抗癌活性的重要作用途徑[2-3]。 本研究結果表明，ASMq對MDR/mRNA表達有明顯的抑制作用。我們對MRP、GST-π和TopoⅡ基因表達進行了同步觀察，發現ASMq同樣可以升高TopoⅡαmRNA水平，提示ASMq也是TopoⅡα耐藥逆轉劑。我們首次證實了ASMq具有明顯的逆轉肝癌Bel/Fu細胞株MDR的作用，其部分機理：抑制Bel/Fu細胞株MDR1 mRNA表達，升高TopoⅡα mRNA水平。由于ASMq毒副作用非常小，因此，有良好的臨床應用前景。

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