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關于結核分枝桿菌的耐藥性檢測方法

呂春林

【摘要】 在應用抗結核藥物治療結核病時,最為臨床醫師所關注的是細菌產生的耐藥性。因為結核分枝桿菌對治療藥物不可避免的產生耐藥性,而影響肺結核病的治療效果。以致成難治型肺結核。

【關鍵詞】 抗結核藥物 耐藥性 檢測

為使抗結核藥物對肺結核病的治療取得預期效果,在應用藥物治療之先,需要了解幾個問題:

一、試管內的抑菌濃度

把抗結核藥物加入培養基內,接種細菌以觀察藥物在多少濃度下能夠抑制細菌生長,求出最小的抑菌藥物濃度(MIC),MIC是臨床確定治療藥物劑量的依據。有關抗結核藥物的MIC,請見短程化療的細菌學基礎。

應用不同培養基所測得的抑菌濃度有差異。如在改良羅氏培養基測得的抑菌濃度比液體培養基或半流體培養基測得的抑菌濃度偏高。

細菌在發育生長旺盛期對藥物敏感,當細菌處于發育生長靜止狀態以致處于休眠期則藥物不呈現抑菌效果。依據細菌發育生長的興衰階段,構成肺結核病治療的基礎。

二、血液內的藥物濃度

血液內抗結核藥物濃度測定是研究藥物在機體內的吸收與排泄,療效與毒性的關系,體液內藥物含量、分布、對細菌的有效抑菌濃度等??纱_定藥物有效治療劑量與用藥次數等。

由于結核病類型和發病部位不同,病變性質不同,有的藥物吸收比較快、有的藥物吸收比較慢。有的體液內含藥物濃度比較高,有的體液內含藥物濃度比較低。即使在相同的藥物治療條件下,各器官、組織內的含藥物濃度不盡相同,其間的差異是比較大的。

因此,血液內藥物濃度的測定,在抗結核藥物治療前和治療中均應進行藥物濃度測定,以了解個體的藥物代謝規律。對某些病例而言,可以起到抗結核藥物治療效果的監控作用。

一般規律。肌內注射法給藥吸收比較快、口服法給藥吸收比較慢。肌內注射法后30~60min,口服法后1~2h,血液內藥物濃度即出現高峰曲線。

內科研究室用生物學方法,觀察鏈霉素肌注后,藥物在體內的吸收,排泄的規律性,提供的技術資料為肺結核病的治療確定用藥劑量和給藥次數等以供參考。

口服利福平450mg后,按規定時間采集血液、尿液和痰液標本,用生物學方法測定藥物在體液內的分布和排泄情況,利福平的吸收和代謝進程。

測定結果說明:口服利福平450mg后、3h血清內達到12fcg/ml的藥物濃度、而痰液內的藥物高濃度是在服藥后6h含量3.31μg/ml. 3h從尿液內排出的利福平劑量68.5μ/m1,至24h尿液內仍能夠排出20μg/ml。

對脊椎結核病人應用異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇等藥物的代謝進行觀察。膿液內的藥物濃度高峰曲線出現的時間不同,有的病人膿液內藥物高峰曲線出現在4h,而有的病人出現在8h,說明個體和病變部位,以及病變性質等不同而出現藥物濃度的差異。

化學測定法:此方法取得的結果雖然比較精確,但是,需要比較精密的儀器設備,如分光光度計、熒光光度計、紫外分光光度計等。此外,化學測定法需要標本數量較多,同一個化學測定法不能應用于血液、尿液、痰液、腦脊髓液和胸腹水等體液標本的檢測。必須是不同體液應用各自的化學測定法。所以,臨床實驗室多采用生物學測定法。

生物學測定法:首先選取對抗結核藥物最敏感的標準菌株。標準菌株先選對普通細菌敏感者,用普通細菌標準株進行測定,對普通細菌不敏感的藥物,選用分枝桿菌進行測定。選妥標準菌株后,測得已知藥物濃度的抑菌圈(帶)直徑(高度),制備標準曲線表。再測定待檢標本的抑菌圈直徑。從標準藥物濃度曲線表求得待檢標本內的藥物含量。

液相色譜測定法:液相色譜儀是比較精密的昂貴的儀器,尚不能為臨床實驗室所應用。

三、耐藥性測定方法

多年來,許多方法提出用于結核分枝桿菌耐藥性測定。目前有三種間接耐藥性測定方法應用于臨床細菌學檢查實驗室。即絕對濃度法,耐藥比率法和耐藥比例法。

長期以來國內各臨床細菌檢查實驗室普遍應用絕對濃度法進行結核分枝桿菌的耐藥性測定。

1.絕對濃度法 試驗是按照抑制某一控制接種物生長的最低藥物濃度,耐藥性的判定是以某一特定藥物濃度的細菌生長超過某一確定的細菌菌落數(一般為20)而決定。

藥物的“臨界”濃度指抑制“野生”型親代細菌生長程度,而對耐藥性變異株達不到如此高的抑菌濃度。耐藥“臨界”濃度的確定需要各實驗室對一定數量的“野生”株測定后加以決定。并應標準化。各實驗室的耐藥性試驗結果才可進行比較。

絕對濃度法耐藥性測定時,含藥培養基的制備,待測菌液的配制和接種時菌液的均勻性等都是測定法中的關鍵。

培養基可以改良羅氏培養基或1%小川培養基。所用藥品必須是純品,按出廠數價計算劑量,在有效期謨τ謾?br /> 所用藥物必須用分析天秤(1/1000)精確稱量。對不溶于水的藥物如利福平類、乙(丙)硫異煙胺、氮苯硫脲等藥物稱量后先用適量二甲基甲酰胺(或二甲基亞砜)完全溶解后,氟哌酸類藥物加適量1%氫氧化鈉液完全溶解后,再加水稀釋至需用量。利福平類藥物也可用無水乙醇或甲醇等試劑溶解。

待測菌株菌液的制備:取分離培養后生長的菌株轉種在改良羅氏培養基生長旺盛的2~3周的菌落,用磨菌器仔細研磨成乳液樣菌液、滅菌水稀釋至1mg/ml的均勻菌液,備用。

試管法:試管法是目前臨床細菌學實驗室普遍應用的結核分枝桿菌耐藥性測定法。具體操作法和步驟,見肺結核病診斷章,結核分枝桿菌實驗室診斷技術。

微量法:微量法是70年代由川達村氏建立的結核分枝桿菌微型測定器檢測耐藥性法,又稱試劑盒測定法。

直立擴散法:直立擴散法是用特制的直立擴散試管進行。試管高度與口徑同中試管(18mm×180mm)。在試管上部約1/5處有約45度的彎度,以阻止培養外溢,使試管內培養基厚度保持一致。在試管側面自下向上標有100mm的刻度,以便直接測出抑菌帶高度。 2.比率法

此種測定法和絕對濃度法用相同培養基。制備一套平行的藥物敏感性試驗培養基。需要配制多個含藥濃度的培養基。同時接種標準結核分枝桿菌(H37RV)和待測菌。以待測菌的最低抑菌濃度和標準菌的最低抑菌濃度之比,接種菌量必需標準化。

耐藥結果判定:待測菌的耐藥比率>8者為耐藥,耐藥比率<2者為敏感、耐藥比率為4,按可疑或臨界判定。

比率法需要進行標準菌株的對測定藥物的MIC測定,需要很好設計一套平行的藥物試驗培養基。操作比較繁多,不舉例試驗說明。

3.耐藥比例法

比例法是對照培養基和含藥培養基、同時接種相同體積的稀釋一定濃度的待測菌液。培養一定時間,在某一濃度的含藥培養取得可計數菌落數和對照培養基取得可計數菌落數相比,以百分率表示之。大于1%者為耐藥。

比例法耐藥性測定 比例法和絕對濃度法一樣,均可采用直接耐藥性測定法和間接耐藥性測定法。

直接耐藥性測定法是選擇涂片抗酸染色陽性痰標本,經稀釋后接種。由于痰標本內的細菌數量難以掌握以及對細菌是活菌或死菌的情況不明,接種后的培養基常無細菌生長等因果關系,直接法現不為實驗室所應用。

菌液濃度,選用接種改良羅氏培養基生長2~3周的旺盛菌落,配1mg/ml的菌液,以滅菌水稀釋至10-2、10-4的菌液,分別接種對照培養基和含藥培養基(各接種0.01ml)。

結果與報告:接種后,37℃孵箱培養4周報告耐藥性測定結果。如果對照培養基生長的菌落數目在5個以下,應重復試驗,含藥培養基未生長出可計數菌落,也應重復試驗。

計數對照培養基和含藥培養基上生長菌落數,計算出耐藥菌的百分比。

參 考 文 獻

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