作者：瑪依努爾·艾力，哈木拉提·吾甫爾

【摘要】 目的 研究維吾爾藥異常黑膽質成熟劑總黃酮(ASMq)體外對肝癌耐藥細胞株 Bel/Fu逆轉腫瘤耐藥性的作用。方法 應用MTT法測定應用ASMq前后5-Fu對Bel/Fu耐藥細胞株的IC50，計算其逆轉倍數；濃度依賴試驗確定ASMq逆轉濃度；耐藥性的集落形成實驗初步確定ASMq 逆轉Bel/Fu的作用。結果 ASMq對Bel/Fu細胞 IC50 是2 000.68 μg/mL，其濃度為390 μg/mL時對細胞無明顯的殺傷作用，逆轉倍數為7.8，與抗癌藥物5-Fu有協同作用，CDI為0.89。集落形成實驗從形態上證實ASMq逆轉MDR 作用，隨ASMq濃度的加大集落逐漸變小。結論 ASMq對肝癌耐藥細胞株Bel/Fu細胞多藥耐藥有逆轉作用。

【關鍵詞】 維吾爾藥；異常黑膽質成熟劑總黃酮；肝癌；多藥耐藥性

Abstract：Objective To investigate the reverse effect of the extracted solution of uygur medicine ASMq on the liver cancer drug-resistance cell line Bel/Fu in vitro. Methods MTT assay was used to determine the IC50 of 5-Fu on Bel/Fu cell line and the reverse multiples of the drug-resistance before and after ASMq treatment. The concentration was used to determine the fold reversal of ASMq. By clone forming text to determine the reversal effect on drug resistance of Bel/Fu cell line. Results The IC50 value of ASMq crude extract was 2 000.68 μg/mL. ASMq at 390 μg/mL concentration was no toxic but had a coordinate effect on Bel/Fu cell line with 5-Fu. The fold reversal of ASMq combining with 5-Fu was 7.8， CDI was 0.89. The clone forming size became smaller comply with the concentration of ASMq. Conclusion ASMq has reversal effect on drug resistance of Bel/Fu cell line. Key words：uygur traditional medicine；ASMq；liver cancer；multi-drug resistance

肝癌在我國是多發腫瘤之一。多數肝癌發現時已經是中晚期，因失去手術機會，化學藥物治療為最常用的治療方法。合理的化療方案能最大限度發揮其細胞毒作用。但是，有些肝細胞癌在經歷了最初有效化療后，最終難免復發，主要原因就是肝癌細胞對化療藥物產生多藥耐藥性(MDR)。如何克服MDR，即逆轉MDR是肝癌化療取得療效的關鍵。本研究選用耐藥肝癌細胞株Bel/5-Fu[1]作為研究對象，旨在探討異常黑膽質成熟劑總黃酮(ASMq)對肝癌細胞體外耐藥性逆轉作用。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

ASMq，新疆維吾爾醫研究所提供；Bel/Fu，南京凱基公司產品；RPMI 1640，美國Gibco公司產品；藍四唑，Sigma公司產品；胰蛋白酶，Gibco公司產品；胎牛血清，南京凱基生物公司試劑；青霉素(100 萬單位)、鏈霉素(160 萬單位)，東北制藥廠產品；MTT、DMSO，Sigma公司產品。

1.2 肝癌細胞株 Bel/Fu復蘇、培養、傳代和凍存

從液氮中取出凍存細胞，立即置于 42 ℃水溶液中，使細胞快速解凍，室溫1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮的含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養液，移至培養瓶中，37 ℃、5% CO2孵箱中培養，以后每2～3 d換1次培養液，待細胞長滿后傳代。當細胞長滿后，傾去培養液，加入0.25%胰酶消化適當時間后，棄去消化液，加入RPMI 1640培養液，用吸管反復吹打，使其成單個細胞懸液，即可繼續傳代培養或將細胞加入凍存管中置于液氮中凍存備用。

1.3 ASMq的IC50測定

用0.25%胰酶消化處于對數生長期細胞，用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養液配成單細胞懸液，3×103細胞/mL，接種于96孔培養板中，每孔體積200 μL，待細胞貼壁后，每孔加入5 μL BCDC，藥物終濃度分別為50、100、200、300、400、600 μg/mL，每個濃度3個孔，同時設不加藥對照孔、培養液空白孔、對照孔各3孔，37 ℃、5% CO2培養4 d后，每孔加入50 μL MTT(5 mg/mL)，繼續培養4 h后，移去上清并用吸水紙吸干培養液，每孔再加入150 μL DMSO，振蕩至結晶完全溶解后，用酶標儀測定490 nm的A值。

1.4 ASMq 逆轉 Bel/Fu耐藥性的濃度依賴實驗

用0.25%胰酶消化處于對數生長期細胞，用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養液配成單細胞懸液，3×103細胞/mL，接種于96孔培養板中，每孔體積200 μL，待細胞貼壁后，每孔加藥。實驗分組如下：ASMq組加5 μL ASMq，使其終濃度為 300、320、340、350、360、380、390、400 μg/mL，共8個組；ASMq＋5-Fu組加5 μL ASMq，使其終濃度為300、320、340、350、360、380、390、400 μg/mL，共8個組，每組每孔均加入5 μL 5-Fu(終濃度為 0.02 μg/mL)；細胞對照組不加藥物。5-Fu組每孔僅75 μL 5-Fu(終濃度為 0.02 μg/mL)。同時設培養液空白對照。所有實驗各設3個平行孔，37 ℃、5% CO2培養4 d后，每孔加入50 μL MTT(1 mg/mL)，繼續培養 4 h后，移去上清并用吸水紙吸干培養液，每孔再加入150 μL DMSO，振蕩至結晶完全溶解后，用酶標儀測定490 nm的A值。

1.5 ASMq 逆轉Bel/Fu耐藥的作用研究

實驗方法同1.4，但ASMq僅選用390 μg/mL一個濃度。藥物聯合應用評價，兩藥相互作用指數(CDI)計算公式為：CDI＝AB/(A×B)，根據吸光度計算，AB 為兩藥聯合應用組與對照組的比值，A、B是藥物單獨作用與對照組的比值，當CDI<1時兩藥有協同作用。

1.6 ASMq逆轉Bel/Fu耐藥性的集落形成實驗

收集處于對數生長期的細胞，計數細胞，并用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液稀釋成1×103/mL細胞懸液，分別加入25 mL培養瓶中，每瓶加1×103/mL細胞懸液，每瓶再加入2 mL 10% FBS＋1640 培養液，十字方向搖勻細胞。37 ℃、5% CO2培養。待細胞貼壁后，再加入藥物，分組如下：ASMq組加75 μL ASMq，使其終濃度為300、390、460 μg/mL 3個組。ASMq＋5-Fu組加75 μL ASMq，使其終濃度為300、390、460 μg/mL 3個組。每組每瓶均加入75 μL 5-Fu(終濃度為0.02 μg/mL)。細胞對照組不加藥物；5-Fu組每孔僅75 μL 5-Fu(終濃度為 0.02 μg/mL)。所有組設3個平行樣，繼續培養10 d，10 d后于倒置顯微鏡下觀察集落形成情況。

1.7 統計學方法

IC50應用線形回歸方法計算，不同藥物組之間應用t檢驗。

細胞存活(%)＝劑量組OD490平均值－空白組OD490平均值 陰性對照組OD490平均值－空白組OD490平均值

逆轉倍數＝ 逆轉劑加抗癌藥物組細胞死亡率抗癌藥物組細胞死亡率

2 結果

2.1 ASMq對Bel/Fu細胞的IC50測定

選用 ASMq 6 個濃度作用Bel/Fu細胞，計算出各濃度細胞抑制率，并計算出IC50。求得 IC50為2 000.68 μg/mL。

2.2 ASMq逆轉Bel/Fu 耐藥的濃度依賴實驗

細胞對照組與5-Fu組比無顯著差異，證明為5-Fu耐藥細胞株；300～390 μg/mL ASMq 與細胞對照組比無差異，沒顯示抑瘤作用，但400 μg/mL 與細胞對照組比有差異，表現出抑瘤作用；5-Fu ＋ASMq 390、400 μg/mL與5-Fu組比有顯著差異。

2.3 ASMq 逆轉 Bel/Fu 耐藥的作用

MTT法測定ASMq在 390 μg/mL濃度時對細胞無明顯的殺傷作用，但與抗癌藥物5-Fu合用時，合并用藥組的細胞毒性作用與單獨用5-Fu抗癌藥物相比有顯著差異(P<0.01)，CDI為0.89，表明ASMq與抗癌藥物有協同作用，逆轉倍數為7.8。

2.4 ASMq逆轉 Bel/Fu耐藥性的集落形成

細胞對照組的細胞可見許多大的圓形集落形成，細胞形態較好，排列緊密灰角形集落形成率37.6%；5-Fu組細胞和細胞對照組基本一致，集落形成率36.7%；ASMq 300 μg/mL基本同細胞對照組，但隨ASMq濃度的加大，集落逐漸變小，數目也減少，細胞中毒現象增多，集落形成率分別為24.9%、14.8%、8.1%；5-Fu組ASMq＋300、390、460 μg/mL 組：300 μg/mL 集落變小數目也減小，細胞可見毒顆粒，460 μg/mL基本無集落形成，僅見散在的細胞碎片或幾個怪異形狀細胞，集落形成率分別為19.5%、3.5%、0%。

3 討論

腫瘤的MDR是腫瘤化療的一大障礙，因此研制能逆轉MDR的化療增效劑是腫瘤研究的一大熱點。已發現異博定能通過增加細胞內藥物濃度來逆轉抗癌藥物，但毒副作用限制了其應用[2]。從天然產物中已發現了一些逆轉耐藥性的成分，其中具有鈣離子通道拮抗作用的雙芐基異喹啉生物堿研究較多[3]。

以往研究表明，ASMq對HepG2細胞體外生長具有較強的抑制作用，通過裂解癌細胞DNA，在凝膠電泳上產生明顯的DNA ladder，從而引起癌細胞凋亡。另外，異常黑膽質成熟劑總黃酮阻止癌細胞進入G0/G，提高sub-G1期的百分比，影響細胞的正常生長，進而誘導癌細胞發生凋亡。ASMq可以濃度依賴性地抑制抗凋亡基因Bcl-2表達，促進促凋亡基因p53、p21、Bax表達水平。因此，認為抑制癌細胞生長、引起DNA鏈斷裂、誘導癌細胞凋亡、調節凋亡相關的Bcl-2、p53、p21、Bax等基因mRNA表達水平等，可能是ASMq發揮抗癌活性的重要作用途徑[4-5]。

本研究選用對5-Fu耐藥肝癌細胞株Bel/Fu為對象，研究ASMq逆轉MDR作用[3]。結果顯示，ASMq原藥材IC50為2 000.68 μg/mL，用藥安全范圍很大。ASMq在390 μg/mL濃度時對細胞無明顯的殺傷作用，但與抗癌藥物5-Fu合用時，與單獨用5-Fu抗癌藥物比較有顯著差異(P<0.01)。表明ASMq與抗癌藥物有協同作用。390 μg/mL 以下濃度時沒表現出明顯的抑瘤作用，和5-Fu組沒有協同作用；而大于400 μg/mL時有協同作用，同時也表現明顯的抑瘤作用。

集落形成實驗從形態上證實ASMq逆轉MDR作用，隨濃度的加大集落逐漸變小、集落形成率減少、細胞中毒現象也增多。5-Fu＋ASMq組隨濃度加大，集落變小、集落形成率減小、細胞毒顆粒的程度更明顯，390 μg/mL 時表現為極小的集落，集落形成率僅為3.5%、細胞形狀不規則有中毒顆粒，排列非常散可見幾個怪異的細胞，460 μg/mL 基本無集落形成，僅見散在的細胞碎片或幾個怪異形狀細胞。集落形成實驗證明，ASMq對肝癌耐藥細胞株Bel/Fu細胞 MDR 有逆轉作用。

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