作者：盧榕邵振俊楊文吉周黎明

【摘要】 目的：測定銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥性。方法：采用瓊脂二倍稀釋法測定銅鋁假單胞菌對頭孢噻肟的MIC值。用銅綠假單胞菌 ATCC27853標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。按照美國臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）2004年頒布的標(biāo)準(zhǔn)操作和判定結(jié)果。結(jié)果：銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥率為59.18%。結(jié)論：臨床分離的銅綠假單胞菌對頭孢噻肟高度耐藥，應(yīng)考慮通過進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，合理選用抗生素，或選用有協(xié)同作用的二聯(lián)療法來提高抗銅綠假單胞菌感染的療效。

【關(guān)鍵詞】 銅綠假單胞菌；頭孢噻肟；耐藥性

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 是氧化酶陽性的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是臨床最常見的條件致病菌。隨著抗生素及某些醫(yī)療技術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用，臨床抗生素的預(yù)防用藥和不合理應(yīng)用，該菌耐藥性日趨嚴(yán)重[1]。而頭孢噻肟（cefetaxime）屬第三代頭孢菌素，具有廣譜、低毒、高效、耐酶等特點(diǎn)，對革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抗菌作用。但隨著該藥的廣泛使用，耐藥菌與日俱增。為研究銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥性，以便為臨床合理使用抗生素提供參考，現(xiàn)測定我院臨床分離的49株銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的的最小抑菌濃度(MIC)，分析其對頭孢噻肟的耐藥性。

1 材料與方法

1.1材料

菌株：本實(shí)驗(yàn)所選用的49株銅綠假單胞菌均來源于四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科臨床微生物室，均去除了同一病人的重復(fù)菌株。操作嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。其中44株來源于痰，2株來源于全血，1株來源于膿液，1株來源于分泌物，1株來源于咽拭子。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌 ATCC27853；藥物：注射用頭孢噻肟鈉（cefetaxime，CTX），規(guī)格為1.0 g/瓶，批號20020901，為哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。其他實(shí)驗(yàn)試劑由本室提供；MH培養(yǎng)基：為Sigma公司產(chǎn)品（牛肉浸膏3 g，可溶性淀粉1.5 g，酪蛋白水解物17.5 g，蒸餾水1 000 ml，置于沸水浴混勻，調(diào)pH至7.4，置于103.43 kPa高壓滅菌15 min）；實(shí)驗(yàn)器材及儀器：超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠產(chǎn)品。其他實(shí)驗(yàn)器材均由本室提供。

1.2方法

采用瓊脂二倍稀釋法[2]。取9個(gè)培養(yǎng)皿，編號19，除1號外其余均加入MH培養(yǎng)基2 ml，然后用MH肉湯稀釋頭孢噻肟鈉原液至1024 μg/mL，分別在1號和2號培養(yǎng)皿中加入2 ml，2號培養(yǎng)皿混勻后吸出2 ml加到3號培養(yǎng)皿中，依次對倍稀釋至9號培養(yǎng)皿，吸出2 ml棄去；待高溫消毒后的MH瓊脂培養(yǎng)基冷卻至60 ℃后分別吸出18 ml加到19號培養(yǎng)皿中（藥物：瓊脂=1∶9），邊加邊搖晃培養(yǎng)皿，使藥物和培養(yǎng)基充分混勻，冷卻后備用。生長后的菌液用3～5 ml生理鹽水校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛龋蠹s為108CFU/mL，用MH培養(yǎng)基稀釋1∶10（含菌量約為107CFU﹒ml-1），用微量加樣槍依次從低濃度到高濃度加入2 μl的檢測菌液。待菌液干后將培養(yǎng)皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜。結(jié)果判斷：菌落生長被完全抑制的最低的頭孢噻肟的藥物濃度為該藥對檢測菌的MIC值。質(zhì)量控制：每個(gè)培養(yǎng)皿同時(shí)接種了標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌 ATCC27853。若頭孢噻肟對標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC在質(zhì)控允許范圍內(nèi)（根據(jù)NCCLS2004年頒布的標(biāo)準(zhǔn)），則證明此次結(jié)果準(zhǔn)確可靠。若超過或低于一個(gè)稀釋度以上時(shí)，結(jié)果無效，重新實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

表1 49株銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥率表2 49株耐藥的銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥情

3 討論

通過測定我院臨床分離的49株銅綠假單胞菌對頭孢噻肟(CTX)的的最小抑菌濃度(MIC)，可以發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌對頭孢噻肟有較高的耐藥率，同現(xiàn)有的許多報(bào)道一致，如蘆杰等的報(bào)道顯示，從吉林省兩家醫(yī)院2003 年和2004年分離出的278 株銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥率為63%[3]；許宏濤等的報(bào)道顯示，從衛(wèi)生部北京醫(yī)院分離出的963株銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥率超過了90%[4]。銅綠假單胞菌不僅對頭孢噻肟的耐藥率高，其對第三代頭孢菌素及氟喹諾酮類等抗生素的耐藥率也不斷增高，華西醫(yī)院的杜曉青等的研究就顯示銅綠假單胞對頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、環(huán)丙沙星、慶大霉素有較高的耐藥性[5]。近年來由銅綠假單胞菌引起的感染病例逐年增加，隨著耐藥菌與日俱增，臨床上對銅綠假單胞菌的治療，顯得越來越棘手，而其耐藥性的研究，則越來越重要。

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界，如正常人的皮膚、腸道、呼吸道和醫(yī)院病房、醫(yī)療器械等均有其分布，是臨床上假單胞菌屬中最常見的條件致病菌，機(jī)體免疫力低下時(shí)，該菌可引起皮膚化膿性感染、呼吸道感染、泌尿道感染、燒傷等， 亦可導(dǎo)致菌血癥、腦膜炎等嚴(yán)重感染。由于銅綠假單胞菌結(jié)構(gòu)上的特殊性和生物學(xué)特性，導(dǎo)致它對多種抗菌藥物表現(xiàn)出天然的耐藥，其耐藥機(jī)理十分復(fù)雜:如①銅綠假單胞菌外膜通透性很低，該菌的LPS分子有6～7條脂肪酸鏈相互共價(jià)連接，使得膜流動(dòng)性非常低，對藥物的屏障作用十分強(qiáng)，它的非特異性通透性僅為大腸桿菌的0.2 %-1 %；②銅綠假單胞菌與抗生素接觸后，還可產(chǎn)生產(chǎn)生抗生素滅活酶或修飾酶。其中細(xì)菌產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌耐藥的最重要的機(jī)制之一，產(chǎn)酶菌通過對β內(nèi)酰胺類抗生素的水解作用，使其能在有β內(nèi)酰胺類抗生素存在的環(huán)境下生存；③降低抗生素作用位點(diǎn)的敏感性，銅綠假單胞菌通過改變抗菌藥物的作用位點(diǎn)青霉素結(jié)合蛋白和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的結(jié)構(gòu)，對β內(nèi)酰胺類和喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥；④銅綠假單胞菌通過缺失典型的孔道蛋白(porin)而降低了抗生素的通透性，它的孔蛋白具有特殊性，在維持銅綠假單胞菌基本生理代謝的同時(shí)，即使小分子水溶性抗菌素通過孔道的速度依然很慢，因而銅綠假單胞菌具有天然的多重耐藥性；⑤外排各種物質(zhì)的復(fù)雜的主動(dòng)排出系統(tǒng)，許多研究表明銅綠假單胞菌細(xì)胞膜上的許多蛋白的確具有將抗菌藥物主動(dòng)外排的作用，并與其細(xì)胞外膜的低通透性協(xié)同作用，導(dǎo)致銅綠假單胞菌固有多重耐藥。銅綠假單胞菌細(xì)胞膜上的主動(dòng)外排蛋白是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對多種抗生素表現(xiàn)固有或獲得性多重耐藥的原因。這些蛋白包括:轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素的內(nèi)膜蛋白MexB、MexD、MexF或MexY;控制抗生素進(jìn)出細(xì)胞的外膜通道蛋白OprM、OprJ或OprN；連接膜與相關(guān)外排蛋白的膜連接蛋白MexA、MexC、MexE或MexX。銅綠假單胞菌細(xì)胞膜上的這些主動(dòng)外排蛋白組成四類主動(dòng)外排系統(tǒng)，即MexAB  OprM、MexCD  OprJ、MexEF  OprN和MexXY OprM；⑥銅綠假單胞菌生物被膜的形成嚴(yán)重影響抗生素的進(jìn)入，降低抗生素進(jìn)入該菌的有效濃度。細(xì)菌生物膜是由細(xì)菌和它所分泌的胞外多聚物組成的外觀呈膜狀的多菌集合體(community)，是細(xì)菌在生長過程中，為了適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種與游走細(xì)胞相對應(yīng)的存在形式，它具有極強(qiáng)的耐藥性和抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)作用的能力。細(xì)菌生物膜表現(xiàn)出的這種極強(qiáng)耐藥性的機(jī)理目前還不十分清楚，有滲透限制、營養(yǎng)限制和表型推斷三種學(xué)說，而銅綠假單胞菌極易形成生物膜等[3][6]。

頭孢菌素類抗生素是在頭孢菌素母核7氨基頭孢烷酸（7ACA）基礎(chǔ)上用化學(xué)方法連接不同的側(cè)鏈而成的半合成抗生素，母核中一個(gè)環(huán)是六元雙氫噻嗪環(huán)，另一個(gè)環(huán)是β內(nèi)酰胺環(huán)，該環(huán)對抗菌活性起重要作用，所以銅綠假單胞菌產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是該菌耐頭孢菌素類抗生素的最重要的機(jī)制之一。謝芬[7]等研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌對試驗(yàn)所用的頭孢菌素類抗生素的平均耐藥率大大超過了非產(chǎn)酶的銅綠假單胞菌，其中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥率為66.67%，而非產(chǎn)酶的銅綠假單胞菌對頭孢噻肟的耐藥率為33.33%[7]。以上顯示，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是我院臨床分離的銅綠假單胞菌耐頭孢菌素類抗生素的重要原因。