【摘要】 ：【目的】采用血清藥理學方法探討補腎健脾方體外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。【方法】補腎健脾方低、中、高劑量（分別為30.2、60.4、120.8g·kg-1)灌胃正常大鼠制備血清，將含藥血清直接添加于體外培養的2.2.15細胞中，培養10d，觀察含藥血清對2.2.15細胞HBV表面抗原（HBsAg）、HBV e抗原（HBeAg）分泌的影響。 【結果】補腎健脾方經體內代謝后能抑制2.2.15細胞HBsAg、HBeAg的分泌，并呈一定的量效與時效關系。低劑量組服藥后3h 1：4稀釋度含藥血清的HBeAg抑制率最高，為97.91%；而中劑量組服藥后3h 1：2稀釋度的含藥血清則達到抑制HBsAg的飽和量，其抑制率為86.84%。【結論】補腎健脾方具有一定的體外抗HBV作用。

【關鍵詞】 補腎健脾方/藥理學 肝炎病毒 乙型/藥物作用 細胞培養 血清藥理學

乙型肝炎病毒（HBV）感染至今仍無較理想、穩定的治療藥物，拉米夫定等核酸抑制劑雖被認為是目前治療HBV感染最有希望的藥物［1］，但停藥后易復發，并可引起HBV突變，產生耐藥性，因而需要尋找更好的抗病毒藥物。目前抗HBV藥物的體外篩選主要通過藥物直接作用于2.2.15細胞，觀察其毒性及對HBV表面抗原（HBsAg）、HBVe抗原（HBeAg）分泌的影響來判斷［2-3］。但藥物直接作用有效并不等于口服吸收經體內代謝后仍有效，因此，本實驗采用血清藥理學方法來探討中藥復方的體外抗HBV作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物

補腎健脾方(藥材均取自廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科)組成：豬苓20g，茯苓20g，白術15g，澤瀉20g，黃芪30g，桑寄生30g，仙靈脾12g，葛根30g，苦味葉下珠30g，白花蛇舌草30g，白背葉根30g，山楂15g，丹參20g。按原方的劑量(總藥量為302g)常規煎煮，并濃縮成3.02g/mL的濃度。

1.2 試劑

DMEM(GIBCO)培養基（華美生物工程公司），另加入新霉素 (G418，由GIBCO提供)0.38g/L， HEPES(緩沖液)2.38g/L；四甲基偶氮唑鹽 (MTT，由SIGMA公司提供)以DMEM培養基作溶劑配成0.4g/L；二甲基亞砜(廣州新港化工廠)； HBeAg檢測試劑盒、HBsAg檢測試劑盒（ELISA法，由華美生物工程公司提供）。

1.3 細胞株

2.2.15細胞引自廣州空軍醫院。

1.4 實驗動物

SD大鼠20只，體質量約為250g ，雌雄各半。由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.5 主要儀器

二氧化碳孵箱(NAPCO 5410)；酶標儀(BIORAD:3550)；TILD臺式冷凍離心機。

1.6 實驗方法

1.6.1 細胞培養 將長滿2.2.15細胞的培養瓶用0.6g/L的胰蛋白酶消化2～3min，棄消化液，加少量100g/L DMEM培養液輕輕吹打，將細胞配制成3×108/L單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，其中留2孔作空白對照，其他每孔加細胞懸液0.1mL，空白孔每孔加100g/L DMEM 0.1mL， 37℃、體積分數5%CO2培養48h，貼壁后用于實驗。

1.6.2 藥物血清的制備［4-6］ 20只SD大鼠 隨機分成4組，分別為中藥低、中、高劑量組和正常血清組。正常血清組用2只大鼠，中藥低、中、高劑量組各用6只大鼠，分別按30.2、60.4、120.8g·kg-1劑量灌胃（相當于50kg成人所用劑量的5、10、20倍），每日分2次灌胃，連續3d，末次給藥后1、2、3h（每個劑量的每個時間段各用2只大鼠），于無菌條件下自腹主動脈采血；正常血清組大鼠灌以蒸餾水，并于最后同時采血；靜置后，低溫離心（10000r/min，5min）分離血清，保存于-20℃備用。

1.6.3 含藥血清對細胞的毒性試驗和抑制試驗 將10種不同條件的20份血清（含正常血清2份）分別按1：0、1：1的比例與20g/L DMEM維持液混和，各取100 μL/孔加入1個已滴有2.2.15細胞的96孔細胞板中，即血清終濃度為1：2和1：4，每種血清每個稀釋度取2孔，并設細胞對照組(不加藥)4孔及空白對照組2孔。細胞對照組及空白對照組每孔均加入20g/L DMEM 100μL。

加入血清后培養10d，吸取培養液放入另一個96孔板中，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）進行HBsAg和HBeAg測定，用酶標儀以450nm波長測定D值，求出含藥血清對抗原的抑制百分率［2］：p抑制/%=（D細胞對照組-D給藥組）/（D細胞對照組-D空白對照組）×100%。

藥物對抗原的抑制百分率：p抑制/%=（D正常血清組-D含藥血清組）/（D正常血清組-D空白對照組）×100%。

原96孔板中每孔加0.4g/LMTT0.1mL， 37℃、體積分數5%CO2孵育4h，棄上清后加二甲基亞砜0.1mL溶解，然后以490nm波長比色測定D值，求出含藥血清對細胞的破壞百分率［4］：p抑制/%=（D細胞對照組-D給藥組）/（D細胞對照組-D空白對照組）×100%

1.7 統計方法 組間均數比較采用獨立樣本t檢驗（SPSS 8.0 for windows 統計軟件包）。

2 結果

2.1 含藥血清對2.2.15細胞的毒性作用

MTT的D值能間接反映細胞存活情況，D值越高，細胞存活數目越多，反之亦然。從表1可看出，各組血清對2.2.15細胞無毒性作用，反而能促進其生長，且與一定的血清濃度成正比，與藥物的有無關系不大，這可能與血清中含有豐富的營養成分等物質能促進體外細胞生長有關。

2.2 含藥血清對2.2.15細胞HBsAg、HBeAg分泌的影響

2.2.1 正常血清組與細胞對照組比較

從表1可知，正常血清組HBsAg、HBeAg D值與細胞對照組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。但正常血清組的2個濃度之間均無顯著性差異（P＞0.05），表明正常大鼠血清中可能含有抑制兩抗原分泌的物質，至于具體是什么物質，將有待進一步研究。

2.2.2 中藥各劑量組與細胞對照組比較

表1結果顯示，中藥各劑量組的HBsAg、HBeAg D值與細胞對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），表明含藥血清能抑制兩抗原的分泌。

2.2.3 中藥低、中、高劑量終濃度為1：2的含藥血清與同濃度正常血清組比較表1 含藥血清各劑量組的細胞毒性及對兩抗原的抑制作用

2.2.4 中藥低、中、高劑量終濃度為1：2、1：4的含藥血清組比較

表1結果顯示，除中藥低劑量組兩濃度對HBeAg的抑制無顯著差異外，其他各劑量組均以1：2濃度對兩抗原的抑制作用較強。

2.2.5 中藥低、中、高劑量終濃度為1：2的含藥血清組比較

表1、表2結果顯示，中藥低、中、高劑量1：2含藥血清組間的HBeAg D值均無顯著性差異，其對HBeAg的抑制率分別為94.68%、95.01%、93.77%。HBsAg D值中藥中、高劑量組較低劑量組顯著性降低。

以上結果表明，中藥低劑量終濃度為1：4時已達到最大限度抑制HBeAg的飽和量，而要達到近乎最好的HBsAg抑制效應則須中劑量終濃度為1：2的含藥血清，在這以前，抑制率隨劑量的增加而增高，達到最高抑制效應（飽和量）以后，再加大藥量亦不能使其抑制率顯著增高。

2.2.6 中藥各劑量灌藥后1、2 、3h終濃度為1：4含藥血清對HBeAg抑制作用的比較

從表3可看出，對于HBeAg的抑制作用，中藥低劑量1h與2h無顯著性差異（P＞0.05），而2h與3h則有顯著性差異（P＜0.01），說明灌藥后3h的抑制作用最強。

2.2.7 中藥各劑量組1、2、3h終濃度為1：2含藥血清對HBsAg抑制作用的比較

由表4可看出，對于HBsAg的抑制作用，中藥中劑量1h與2h、2h與3h均無顯著性差異（P＞0.05），而1h與3h則有顯著性差異（P＜0.05），以3h的抑制率最高。

以上含藥血清對兩抗原的抑制率均是藥物和血清共同作用所得的結果。但由于正常血清對兩抗原亦有一定的抑制作用，因此若要排除正常血清作用的干擾，單純考慮藥物經體內代謝后對兩抗原的抑制率，如表5所示：藥物經體內代謝后對2.2.15細胞HBeAg、HBsAg的最高抑制率分別為94.53%和65.75%。 3 討論

現代醫學對慢性乙型肝炎的病原體、流行病學、自然病程、發病機制、病理變化等方面均作了較深入的研究，但至今仍未能找到徹底治療HBV感染的藥物。目前國內有關中醫藥治療慢性乙型肝炎的研究不少，在其病因病機的認識方面也基本一致，主要是"濕熱余邪兼血瘀，肝郁脾腎氣血虛"。我院消化內科羅日永教授在繼承已故肝病名醫鐘耀奎教授學術思想的基礎上，結合自己多年的臨床經驗，提出慢性乙型肝炎的治療關鍵在于補脾腎、清余邪，采用健脾補腎為主，佐以清熱利濕的治法，其自擬的補腎健脾方在臨床治療慢性乙肝患者取得了較好的療效［7］。

根據現代藥理學研究發現［8］，苦味葉下珠、山楂有較強的抗HBV作用，澤瀉有明顯的退黃作用，丹參是目前公認的抗纖維化的良好藥物，而黃表2 不同劑量含藥血清對HBsAg、HBeAg的抑制率表3 中藥各劑量組1、2、3h終濃度為1：4含藥 ①：P＜0.01，與中藥低劑量2 h組比較(vs 2hour lowdose KSP group)芪、白術、茯苓、豬苓、白花蛇舌草、仙靈脾、葛根均有較強的免疫調節作用，如黃芪、豬苓、茯苓能提高巨噬細胞系統吞噬能力及自然殺傷細胞（NK細胞）、淋巴因子激活殺傷細胞（LAK細胞）的活性，使CD3、CD4明顯增高、CD4/CD8比值升高，調節細胞因子，促進產生白細胞介素2（IL2）和IL2受體（IL2R），促進細胞免疫反應及溶解免疫復合物、抗腫瘤作用；白術除能促進免疫功能外，還可增強腎上腺皮質功能及護肝抗腫瘤作用；葛根還可誘導腫瘤壞死因子（TNF）的產生、抑制超敏反應、增強機體抗感染力；白花蛇舌草還有抗腫瘤、抗炎作用 。

補腎健脾方各組成藥物的免疫調節作用基本得到初步的證實，但究竟有無直接抗病毒的作用則未見報道。目前評價藥物體外抗HBV作用常用的2.2.15細胞系是用含有2個頭尾相連HBVDNA全基因的重組質粒轉染受體細胞HepG2而成的［3］，表4 中藥各劑量組1、2、3h終濃度為1：2含藥表5 藥物經體內代謝后對2.2.15細胞兩抗原的能持續高量地分泌HBsAg和HBeAg。而通過藥物對HBsAg、HBeAg分泌的影響，可作為評價藥物體外抗HBV作用的一個指標［2］。由于中藥復方成分復雜，雜質也較多，如果把藥物直接作用于細胞，往往不能真實反映藥物的臨床有效作用。因此，本實驗嘗試采用血清藥理學的方法，希望能更真實地反映藥物通過體內代謝后對細胞的毒性和對兩抗原的作用。本研究結果表明了補腎健脾方藥物經體內代謝后能有效地抑制2.2.15細胞HBsAg和HBeAg的分泌，而無明顯毒性，較藥物直接作用于無毒濃度下的抑制率高［9］，且能更真實地反映藥物的真正抗HBV作用，為體外抗HBV實驗在方法學上的改進提供了依據。從實驗結果中我們發現，HBeAg對藥物敏感性較好，只需較低劑量即可被有效抑制，而HBsAg則需較高劑量才能被有效抑制。

同時，本實驗還發現正常大鼠血清在促進2.2.15細胞生長的同時，能有效地抑制HBsAg和HBeAg的分泌，這到底是由于血清中干擾素等細胞因子的作用所致，還是其他原因所致，尚待進一步研究。

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