作者：曹燕明 徐海波 張薇 陳基長

【關鍵詞】 骨性關節炎/中藥療法;，骨炎定/藥物作用;，細胞培養;，兔

摘要: 【目的】觀察補腎益氣活血方骨炎定對血管內皮細胞增殖的影響?！痉椒ā繉⑿挛魈m兔隨機分為空白組和骨炎定低、中、高劑量組（劑量分別為2.5、5、10g/kg）;以骨炎定高劑量灌胃給藥，連續7d，于最后1次給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h分別取血，分離含藥血清，作用于人臍靜脈內皮細胞，以四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測不同時相的骨炎定含藥血清對血管內皮細胞的增殖作用;并取給藥后2h含藥血清，部分滅活，比較滅活血清與不滅活血清對血管內皮細胞增殖的影響，以及檢測不滅活含藥血清不同作用時間（12、24、36h）對內皮細胞增殖的影響;以骨炎定低、中、高劑量灌胃給藥，連續7d，取最后1次給藥后2h含藥血清，觀察不同劑量骨炎定對血管內皮細胞增殖的影響?！窘Y果】高劑量骨炎定給藥后0.5～4h制備的含藥血清對血管內皮細胞增殖均有顯著促進作用（均P<0.01），其中以給藥后2h者作用最強;滅活與不滅活血清均對血管內皮細胞增殖具有促進作用（P<0.01），且后者作用強于前者（P<0.05）;不滅活含藥血清作用12、24、36h后均對血管內皮細胞增殖具有促進作用（P<0.01），且呈時效關系;低、中、高劑量骨炎定含藥血清均對血管內皮細胞具有促進作用（P<0.01），并呈量效關系。【結論】補腎益氣活血方骨炎定對血管內皮細胞增殖具有促進作用。

關鍵詞: 骨性關節炎/中藥療法; 骨炎定/藥物作用; 細胞培養; 兔

在骨性關節炎（OA）的病理機制中，骨組織血管萎縮、數量減少、血供不足是非常重要的一環，而血管在骨的形成和修復過程中所起的重要作用在于豐富的血管是保障骨組織再生時血供充分的必要條件 ［1］ 。補腎益氣活血方骨炎定（Guyan ding）是陳基長教授根據中醫理論，并結合自己多年的臨床經驗總結出的經驗方，主治骨性關節炎。經多年臨床研究證實，該方可改善OA患者的關節疼痛、腫脹和功能障礙，改善骨內壓和異常的血液循環，在臨床中取得顯著療效 ［2］ 。本文觀察了骨炎定含藥血清對促進血管內皮細胞增殖的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 骨炎定由紅花、牛膝、補骨脂、骨碎補、黃芪組成，按常規方法煎煮，經紗布過濾并濃縮成含生藥2kg/L的藥液，置4℃冰箱保存備用。 1.2 動物 新西蘭兔，雌雄各半，體質量（2.0±0.2）kg，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號為2000A018。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同時相的含藥血清促進血管內皮細胞增殖的作用 ［3-4］ 新西蘭兔4只，隨機分成空白組和骨炎定組，雌雄各半。骨炎定組以10g/kg劑量灌胃給藥，空白組以等容積的蒸餾水灌胃，每天2次，早晚各1次（每日藥物總量相當于60kg成人臨床用量的20倍），連續7d。于最后1次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h兔耳中央動脈采血，無菌分離血清，經0.45μm、0.2μm雙層微孔濾膜過濾除菌，置-40℃低溫冰箱保存備用。將購自CCTCC（中國典型培養物保藏中心）的人臍靜脈內皮細胞培養至第3～5代，以含體積分數為15%小牛血清的DMEM培養液調成5×10 7 個/L的細胞懸液，100μL/孔接種于96孔培養板中，于37℃、體積分數為5%CO 2 溫箱中飽濕靜置培養48h;更換無血清的DMEM培養液，使細胞同步化12h，每孔加入100μL不同時相采集的空白兔血清或骨炎定含藥血清，每組均設8個平行孔，總體積為200μL/孔;置37℃、體積分數為5%CO 2 溫箱中飽濕靜置培養36h，每孔加入5g/L的四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液20μL，繼續培養4h以進行顯色反應;以體積分數為50%二甲基甲酰胺（DMF）―200g/L十二烷基硫酸鈉（SDS）0.1mL終止反應，室溫靜置過夜;待孔內藍色結晶完全溶解后置酶標儀上測波長570nm處吸光度（D）。

1.3.2 血清滅活與否對血管內皮細胞增殖的影響 ［4-5］ 按1.3.1方法選取最后1次灌胃給藥后2h的兔進行耳中央動脈采血，無菌分離血清，一部分血清經56℃、30min滅活處理;一部分不滅活，經0.45μm、0.2μm雙層微孔濾膜過濾除菌，置-40℃低溫冰箱保存備用。采用1.3.1方法檢測滅活血清和不滅活血清對血管內皮細胞增殖的影響。

1.3.3 不同劑量的含藥血清促進血管內皮細胞增殖的作用 ［3，5］新西蘭兔8只，隨機分成空白組和骨炎定低、中、高劑量組，雌雄各半。骨炎定低、中、高劑量組分別以2.5、5、10g/kg灌胃給藥，空白組灌胃等容積的蒸餾水，每天2次，早晚各1次（每日藥物總量分別相當于60kg成人臨床用量的5倍、10倍、20倍），連續7d。于最后1次灌胃后2h兔耳中央動脈采血，無菌分離血清，經0.45μm、0.2μm雙層微孔濾膜過濾除菌，置-40℃低溫冰箱保存備用。采用1.3.1方法檢測不同劑量的含藥血清對血管內皮細胞增殖的作用。

1.3.4 不同作用時間的含藥血清促進血管內皮細胞增殖作用的比較采用1.3.1方法檢測骨炎定含藥血清（10g/kg）作用于血管內皮細胞12、24、36h后的反應。

1.4 統計學處理

數據的統計處理采用SPSS10.0統計軟件包，數據先進行方差齊性檢驗，隨后進行方差分析，最后采用Dunnett法進行組間比較。

2 結果

2.1 不同時相的含藥血清促進血管內皮細胞增殖的作用 表1結果表明，給新西蘭兔每天灌胃2次，早晚各1次，連續7d，于最后1次給藥后2h制備的含藥血清對血管內皮細胞增殖的促進作用最強，與空白組比較，差異具有非常顯著性意義（P<0.01），即給藥后2h血藥濃度達到高峰。經每天在固定時間間隔給藥2次、連續7d的方法可使血藥濃度保持在較高水平內波動，藥后0.5h至4h制備的含藥血清對血管內皮細胞增殖具有較強的促進 作用（均P<0.01）。為了更準確地研究含藥血清對血管內皮細胞增殖的促進作用，在以下的實驗中均采用藥后2h采血的方法制備含藥血清。 2.2 血清滅活與否對血管內皮細胞增殖的影響表2結果表明，滅活與未滅活空白兔血清對血管內皮細胞增殖的影響無顯著性差異（P>0.05）。滅活高劑量含藥血清與未滅活高劑量含藥血清對血管內皮細胞增殖都有顯著的促進作用（P<0.01），且后者作用強于前者（P<0.05）。為了更準確地研究含藥血清對血管內皮細胞增殖的促進作用，在以下的實驗中均采用未滅活血清。

2.3 不同劑量的含藥血清促進血管內皮細胞增殖的作用表3結果表明，骨炎定低、中、高劑量含藥血清對血管內皮細胞增殖均有促進作用（P<0.01），且呈現明顯劑量效應關系。

2.4 骨炎定含藥血清不同作用時間促進血管內皮細胞增殖作用的比較表4結果表明，未滅活空白兔血清能維持血管內皮細胞生長（P<0.05），未滅活高劑量含藥血清在作用12、24、36h后對血管內皮細胞增殖均有顯著的促進作用，且隨著作用時間的延長，其促進作用增強（P<0.01），呈現時間效應關系。

3 討論

骨性關節炎屬于祖國醫學“骨痹”范疇，其病因病機主要為久傷勞挫，瘀血阻絡，肝腎虧損，筋骨虛弱，治療以補肝腎，強筋骨，益氣行血為原則。有研究表明各種致病因子所造成的全身或局部組織器官的缺血、缺氧、血循環障礙、血液流變性及粘滯性異常而導致的各組織器官水腫、炎癥滲出、血栓形成、組織變性、結締組織增生等一系列病理變化，均可概括在血瘀證的病理實質之中，而這些病變的中心環節在于血管內皮細胞的變化 ［6］ 。活血化瘀法可降低骨內壓 ［7］ ，改善骨性關節炎的癥狀 ［8］ 。且既往的研究及觀察發現在胚胎時骨形成與血管生成密切相關 ［9］ 。所謂骨生發中心即位于血管化的環境中，而成骨細胞和骨祖細胞在新骨形成過程中總伴有毗鄰血管內皮細胞存在。無論膜內成骨、軟骨內成骨或骨折愈合均與血管存在與否有著密切的關系。與此同時，還發現當老年試驗對象或患者發生骨質疏松時，總是成骨細胞與血管生成同時減少。芮鋼等 ［10］ 將血管內皮細胞與成骨細胞聯合培養，發現成骨細胞與血管內皮細胞具有良好的 表1 高劑量骨炎定含藥血清對血管內皮細胞增殖影響的變化趨勢細胞相容性，血管內皮細胞能夠增強成骨細胞的功能，提高成骨細胞的增殖能力。血管內皮細胞增生可加速骨組織的再血管化過程，從而為成骨細胞提供正常的營養、神經和體液調控。骨炎定是復方制劑，有的成分對軟骨細胞有保護作用 ［11］ ，有的成分對骨性關節炎的骨壞死有修復作用，本研究結果顯示骨炎定可促進血管內皮細胞的增殖，這是否與該方可修復被破壞的軟骨細胞和骨細胞，緩解骨性關節炎中晚期癥狀的機理有關，有待進一步研究。

本實驗研究還表明，每天在固定時間間隔給藥2次、連續7d的方法可使血藥濃度維持在較高水平內波動，藥后0.5h至4h制備的含藥血清均對血管內皮細胞增殖有較強的促進作用 ［4］ 。滅活與未滅活空白兔血清對血管內皮細胞增殖的影響無顯著 性差異。但未滅活高劑量含藥血清對血管內皮細胞增殖的促進作用比滅活的高劑量含藥血清更強。是否藥物作用于機體后產生了能促進血管內皮細胞增殖的類血管內皮細胞生長因子樣的內源性生理活性物質，而這種內生性有效成分又不耐熱，其原因有待進一步證實。

未滅活低、中、高劑量含藥血清對血管內皮細胞增殖均有促進作用，且呈現劑量效應關系。未滅活高劑量含藥血清在作用12、24、36h后對血管內皮細胞增殖均有促進作用，且隨著作用時間的延長，其促進血管內皮細胞增殖的作用增強。但臨床上究竟采用多大的劑量、多長的療程療效最好，且不良反應最少，也尚需進一步觀察研究。

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