作者：趙長江，袁斌，徐建亞，王莉，孔飛

【摘要】 目的 評價清肺口服液抗呼吸道合胞病毒(RSV)的活性。方法 采用MTT法，以利巴韋林為對照組，觀察清肺口服液及不同給藥方式對RSV的拮抗作用。結(jié)果 清肺口服液具有明顯抗RSV的作用，與利巴韋林比較差異無統(tǒng)計學意義；清肺口服液的作用機制可能為抑制病毒吸附或增殖。結(jié)論 清肺口服液可以通過不同環(huán)節(jié)拮抗RSV病毒，是治療RSV感染的有效復方制劑。

【關(guān)鍵詞】 清肺口服液；呼吸道合胞病毒；中藥血清藥理學

Abstract：Objective To evaluate the anti-RSV activity of Qingfei Oral Liquid. Method With Ribavirin as the control， the antagonistic effect of Qingfei Oral Liquid and different administration methods on RSV infection were observed by MTT technology. Result Qingfei Oral Liquid had obvious effection of anti-RSV， showing no significant difference compared with Ribavirin. The action mechanism may be that Qingfei Oral Liquid has inhibition effects on adsorption or proliferating of RSV. Conclusion Qingfei Oral Liquid can antagonize RSV through different linkages. It is an effective compound preparation for treating RSV infection. Key words：Qingfei Oral Liquid；respiratory syncytial virus；serum pharmacology of traditional Chinese medicine 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是引起嬰幼兒病毒性肺炎和毛細支氣管炎的主要病原體，約占嬰幼兒肺炎病例總數(shù)的5%～40%，同時，也常引起成年人尤其是老年人的呼吸道感染，但目前尚無有效的預防和治療方法。清肺口服液主要由炙麻黃、杏仁、葶藶子、虎杖等藥物組成，臨床研究取得了滿意的效果[1]，但其作用機理尚未完全闡明。本實驗欲從血清藥理學方面對其做一探討。

1 實驗材料

1.1 動物

大耳白兔14只，雌雄不拘，健康無病，體重2.5～3 kg，南京市清涼山實驗動物基地提供，合格證號：SCXK(蘇)2007-0008。

1.2 細胞與病毒 人喉癌表皮細胞Hep-2，由凱基生物科技細胞中心提供，本實驗采用第3～30代細胞。呼吸道合胞病毒B亞型(RSV B型)，博特生物有限公司提供。

1.3 試劑

DMEM(美國GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青公司)；細胞培養(yǎng)液：DMEM加10%新生牛血清；細胞維持液：DMEM加2%新生牛血清；0.25%胰酶(美國GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT，AMERSSCO)；二甲基亞砜(DMSO，上海永華特種化學試劑廠)。

1.4 儀器

酶聯(lián)免疫檢測儀，EXL800型，美國BioTek；倒置顯微鏡， OLYMPUS BX-50。

1.5 藥物及含藥血清的制備

清肺口服液，南京中醫(yī)藥大學植物藥研究中心提供，每劑含原藥材10 mg/mL。含藥血清的制備：清肺口服液給健康大耳白兔灌胃，劑量為48 g/(kg·d)，是臨床等效劑量(12 g/kg)的4倍，每日分2次灌服，連續(xù)給藥3 d。末次給藥后禁食不禁水12 h，在家兔清醒狀態(tài)下頸動脈采血，無菌分離血清，制成血清凍干粉-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r設空白對照，灌服等體積生理鹽水，取血清方法同前。利巴韋林注射液：華北制藥集團制劑有限公司產(chǎn)品，批號051202。

2 實驗方法

2.1 分組

設含藥血清組、空白血清組、利巴韋林組、病毒對照組及細胞對照組。

2.2 細胞培養(yǎng)

將復蘇后的細胞以1×106/瓶接于25 mL培養(yǎng)瓶中，加入3 mL DMEM培養(yǎng)基。置37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞長至約90%后，用0.25%胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)。

2.3 病毒的擴增 待細胞在板或瓶中長滿60%～70%后，吸去液體，加入適量(500～1 000 μL)病毒液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后，補維持液3 mL。逐日觀察細胞病變(CPE，典型病變是融合的大泡)，病變達75%以上時收集病毒。

2.4 利巴韋林及含藥血清最大無毒濃度測定 Hep-2細胞以1×105/mL濃度分種于96孔細胞板，每孔0.1 mL。待80%匯合后，以DMEM稀釋清肺口服液含藥血清和空白血清40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL 7個濃度，用維持液稀釋利巴韋林2、1、0.5、0.25 mg/mL 4個濃度。棄去培養(yǎng)液，分別加入維持液稀釋后的空白血清、含藥血清和利巴韋林，每孔0.1 mL，正常細胞對照組加維持液，每孔0.1 mL。每個濃度4個孔。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察各組致細胞病變作用，測定不引起CPE的最低稀釋度即最大無毒濃度，作為抗病毒實驗的最高允許濃度。

2.5 呼吸道合胞病毒B亞型組織培養(yǎng)半數(shù)感染量的測定 Hep-2細胞以1×105/mL濃度接種96孔細胞板，每孔0.1 mL。用單培維持液10倍系列稀釋病毒懸液，共8個濃度。每次稀釋更換吸管以防止病毒滴度后延。在接種細胞后18～36 h內(nèi)，細胞長成單層時吸棄培養(yǎng)液，PBS洗細胞面，接種系列稀釋的病毒液，每個稀釋度接種5孔，每孔0.1 mL，正常細胞對照孔加入0.1 mL維持液。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，每15 min搖晃1次，使病毒均勻吸附。吸棄病毒液，每孔加入維持液0.1 mL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察病變。以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時為終點，細胞病變程度用“-”～“++++”表示：無細胞病變時為“-”，≤25%細胞出現(xiàn)病變?yōu)椤?”，＞25%～50%為“++”，＞50～75%為“+++”，＞75%為“++++”。根據(jù)Reed-Muench公式[1]計算病毒組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)。

2.6 加入血清的不同時間對病毒的抑制效應 將1×105濃度的Hep-2細胞接種到96孔培養(yǎng)板上，置37 ℃、5%CO2箱培養(yǎng)。待細胞長成單層，在18 h內(nèi)吸棄培養(yǎng)液。a藥物和病毒同時作用于細胞：將1 000 TCID50/50 μL RSV B亞型和清肺口服液含藥血清(10 mg/mL)、空白血清(10 mg/mL)、利巴韋林(0.2 mg/mL)各50 μL分別混合，加入到含有細胞的培養(yǎng)板中。b藥物作用細胞后感染病毒：先加入含藥血清(5 mg/mL)、空白血清(5 mg/mL)、利巴韋林(0.1 mg/mL)各100 μL，12 h后棄去上清，每孔接1 000 TCID50/50 μL RSV B亞型，置37 ℃、5%CO2箱吸附2 h。吸棄病毒液，分別加入用2%維持液，每組5個復孔，每孔100 μL，置35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞病變。72 h后加入MTT(用維持液稀釋1 mg/mL)，每孔20 μL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，160 min后，小心吸棄上清，加入DMSO，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇490 nm波長在酶聯(lián)免疫酶標儀上檢測藥物的細胞活性作用(OD值)，判斷藥物對細胞的保護作用[2]。

3 統(tǒng)計學方法

實驗結(jié)果以x±s表示。應用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，采用方差分析。

4 結(jié)果

4.1 空白血清、含藥血清和利巴韋林在Hep-2的最大無毒濃度測定結(jié)果

在Hep-2中，空白血清的最大無毒濃度為10 mg/mL；清肺口服液含藥血清的最大無毒濃度為10 mg/mL；利巴韋林的最大無毒濃度為0.2 mg/mL。

4.2 呼吸道合胞病毒組織培養(yǎng)半數(shù)感染量結(jié)果

在Hep-2中，RSV B亞型(r6株)TCID50為10～4.83/50 μL。

4.3 清肺口服液對呼吸道合胞病毒的拮抗作用

(見表1)表1 清肺口服液對RSV B亞型致細胞病變的抑制作用(略)注：與病毒對照組比較，*P＜0.05；與空白血清組比較，#P＜0.05

5 討論 上呼吸道感染的發(fā)生約90%由病毒引起，RSV是引起本病的主要病原之一。針對病毒感染，西醫(yī)主要采用病毒唑為主的治療，但尚存在一些問題：小劑量應用時治療效果差，大劑量時會在紅細胞中蓄積，對人體造成傷害。而現(xiàn)代研究顯示，中藥在防治病毒感染性疾病方面有一定的優(yōu)勢。由于以往經(jīng)常采用中藥復方粗提取物直接加入反應體系的方法，干擾因素大，不能反映藥物在體內(nèi)真實的代謝過程。而中藥血清藥理學在一定程度上避免了上述缺點，是研究中藥復方的重要方法。

本實驗結(jié)果表明，清肺口服液具有拮抗RSV感染的作用，與利巴韋林相比無明顯差異，并且具有較高的安全性，以1∶4比例稀釋后對正常細胞不表現(xiàn)出毒性作用。在此基礎上，我們進一步研究了清肺口服液的可能作用環(huán)節(jié)，結(jié)果兩種方法之間無明顯差異，說明清肺口服液對RSV感染的不同環(huán)節(jié)均有一定的拮抗作用。由于血清藥理學是一門年輕的學科，自身仍有許多不完善的地方，如目前血清中有效藥物成分的藥代動力學不清楚，不知何時是藥物的最高血藥濃度，從而導致采血時間難以確定。因此，我們借鑒了通用的方法[3]，即每日2次喂藥，連續(xù)3 d，末次喂藥后1 h采血。下一步我們將進行預實驗，根據(jù)量-效關(guān)系，確定清肺口服液的最佳采血時間，以求實驗的嚴謹性和科學性。