摘 要:目的 研究用轉化生長因子α（TGF-α）反義脫氧寡核苷酸（ASODN）對人大腸癌細胞株HR8348生長增殖的作用，探討大腸癌治療的新途徑. 方法 采用人工合成的TGF-α反義及無關對照ODN經陽離子脂質體包裹后轉染人大腸癌HR8348細胞.采用MTT法，［3 H］-TdR摻入實驗，細胞周期分析，裸鼠體內接種等方法測定瘤細胞體內外增殖的變化. 結果 經TGF-α反義ODN處理的HR8348細胞與對照組HR8348細胞相比，體外增殖速度減慢（細胞增殖抑制率達71%），DNA合成受抑，裸鼠體內成瘤率下降（25%vs100%）. 結論 TGF-α反義ODN能有效抑制大腸癌細胞的體內外生長增殖，可用于實驗性腫瘤基因治療研究.

Keywords:colorectal neoplasms;transforming growth factorα;oligodeoxynucleotides;cell line;liposome

Abstract:AIM To investigate the effects of TGF-αanti-sense oligodeoxynucleotides（ASODN）on human rectal carci-noma cell line HR8348.METHODS Cationic liposome and lipofectamine were selected as a delivery vector.HR8348cells were treated with ASODN in vitro.HR8348cells with or without pretreatment were inoculated into nude mice.RE┐SULTS Proliferation and DNA synthesis of HR8348cells treated with ASODN were greatly inhibited and tumorigenic rate was greatly reduced.CONCLUSION TGF-αASODN could inhibit the proliferation of human colon cancer cell line in vitro as well as in vivo.The results implicate the potential value in colorectal cancer gene therapy.

0 引言

轉化生長因子α（TGF-α）在多種腫瘤中的過表達促進了瘤細胞的增殖、分裂，并與腫瘤的惡性表性有關

［1］ ，有報道稱大腸癌組織中也存在TGF-α的高表達［2，3］ .我們在查明HR8348細胞系存在TGF-α高表達后，用TGF-α反義脫氧寡核苷酸（ASODN）對其進行細胞轉染，研究該反義脫氧寡核苷酸對該細胞系細胞生長的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 材料 人大腸癌細胞株HR8348來源于1例男性直腸腺癌患者的手術切除標本，由中國醫學科學院腫瘤研究所提供，培養在含100mL?L-1 小牛血清的RPMI1640（Gibco公司）培養液，37℃，50mL?L-1 CO2 的環境中.

1.2 合成硫代寡脫氧核苷酸 TGF-α反義脫氧寡核苷酸（ASODN）由18個堿基組成，與TGF-αcDNA前3個密碼子及其上游部位3個密碼子堿基序列互補.反義鏈序列為5’-GGGGACCATTTTACGG-GC-3’;無關對照寡聚核苷酸（N-ODN）由18個堿基隨機組合，序列為5’-GCTAGGATCTGGAGCTCG-3’，經基因庫檢索不與已有的已知編碼序列相互補.以上ODN均用硫代磷酸修飾，由本校生物化學教研室合成.

1.3 脂質體┐ODN復合物的制備 陽離子脂質體LipofectAMINE［4］ 購自Gibco公司，制備前將ODN稀釋于0.1mL無血清無抗生素的RPMI1640中，加入同樣方法稀釋的脂質體，混勻，室溫放置5～10min，即可形成脂質體-ODN復合物并立即用于細胞處理.脂質體與ODN用量參考說明書.

1.4 細胞處理 用無血清無抗生素的RPMI1640稀釋HR8348細胞，接種0.8mL細胞（約1.5×106 個）于35mm培養皿.將脂質體ODN復合物（0.2mL）加入培養皿，充分混勻，添加4mL含血清RPMI1640繼續培養48h，而后收集細胞.

1.5 ODN對HR8348細胞生長增殖的影響 采用MTT法及［3 H］-TdR摻入試驗.取對數生長期細胞用無血清無抗生素RPMI1640稀釋，接種40μL細胞（約1×104 個）于96孔培養板，加入脂質體-ODN復合物，充分混合，培養5h后，添加200μL含血清RPMI1640繼續培養48h.而后吸棄上清，以RPMI1640清洗兩遍，加入RPMI1640液200μL，MTT（5g?L-1 ）20μL，37℃培養4h后吸棄上清液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）200μL，振蕩10min，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測其吸光度，每組復設3孔，取均值.設空白對照、陰性對照各1組.另1個96孔板中同上加入細胞及脂質體-ODN復合物，培養5h后添加200μL含血清RPMI1640繼續培養24h，向培養液中加入［3 H］-TdR，培養24h后按文獻［5］進行測定.

1.6 脂質體為載體對ASODN作用效率的影響 用3’末端標記法將［α-35 S］標記到ASODN上.將細胞（2×10

5 ?mL-1 ）鋪種于24孔培養板，加入脂質體包裝與未包裝的［α-35 S］ASODN，終濃度為10μmol?L-1 ，置37℃50mL?L-1 CO2 孵箱中培養.分別于24，48和72h取出細胞，以PBS洗滌，至上清液放射計數為0.測定細胞中［α-35 S］的放射活性.

1.7 細胞周期動力學分析 將處理細胞經胰蛋白酶消化后，制成1×104 ?L-1 細胞懸液，碘化丙啶（PI）染色，FACScan流式細胞儀測定.

1.8 裸鼠致瘤能力試驗 裸鼠11只分成試驗組、空白組、陰性對照組，分別為4，3和4只，每只于皮下注射1×107 細胞.

2 結果

2.1 ODN對HR8348細胞DNA合成及生長增殖的抑制 TGF-α反義ODN能抑制HR8348細胞的DNA合成及生長增殖.與空白對照組相比，腫瘤細胞生長增殖的抑制率為71%，［3 H］-TdR摻入實驗的抑制率為73%.而經無關對照ODN處理的陰性對照組對HR8348細胞的生長增殖以及DNA合成無 顯著抑制.

2.2 HR8348細胞對［α┐35 S］ASODN的攝入 結果表明，細胞對脂質體包裝組的［α-35 S］攝入量明顯高于未包裝組，這種差別隨時間延長而更加顯著（Tab1）.

表1 HR8348細胞對［α-35 S］ASODN的攝入略

2.3 細胞周期分析 TGF-α反義ODN作用于HR8348后，細胞G0 /G1 期細胞數明顯增多，S期細胞數相應減少，而G2 +M期細胞數亦明顯的減少，而無關ODN組作用明顯減弱，差異明顯（Tab2）. 表2 不同處理HR8348細胞周期分析略

2.4 裸鼠皮下移植瘤生長 空白對照組3只及陰性對照組4只所有接種部位均有移植瘤形成且腫瘤體積大，成瘤率為100%（3/3，4/4），TGF-α反義ODN處理4只，成瘤率低下（25%，1/4），且移植瘤生長緩慢，瘤體小（Tab3）.

表3 ASODN對HR8348細胞裸鼠皮下移植瘤形成的影響略

3 討論

隨著分子生物學技術的發展和對癌基因、生長因子及生長因子受體研究的不斷深入，人們逐漸認識到生長因子及其受體在介導細胞信號轉導、促進細胞分裂和增殖轉化中占有重要地位.促瘤形成的自分泌和旁分泌機制的提出，促進了腫瘤發生機制的深入研究.有許多證據證明TGF-α在腫瘤細胞的惡性增殖中起一定作用，在許多惡性腫瘤中都發現有TGF-α的過度表達，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌［2］ 及前列腺癌等，TGF-α可與EGFR結合而激活受體的酪氨酸酶活性，從而啟動細胞有絲分裂，引起及誘導血管形成和腫瘤生長.已有實驗證明，TGF-α可以通過自分泌機制在細胞的癌變中起一定作用［6-10］ .

本結果顯示，TGF-α反義ODN對人大腸癌細胞株HR8348的生長增殖和DNA合成均有抑制作用，經TGF-α反義ODN處理后的腫瘤細胞的裸鼠體內致瘤能力明顯下降，而經無關對照的ODN處理后的腫瘤細胞無此抑制作用，流式細胞儀的細胞周期分析結果也表明，經TGF-α反義ODN處理的腫瘤細胞生長明顯被阻滯于G0 /G1 期，增殖指數（proliferation Index，PI）明顯低于其他兩組對照組，表明TGF-α反義ODN可阻抑TGF-α與EGFR激活后所促發的細胞向S期過渡及由此導致的細胞過度增殖.TGF-α反義ODN對TGF-α的抑制機制可能為:①直接與TGF-α的mRNA結合誘發內源性核酸酶對雜交體中RNA部分的水解;②封閉酶結合位點;③阻斷前mRNA的剪切;④與雙鏈DNA的某一段特異性結合，形成三螺旋結構［11-15］ .

脂質體是由脂質雙分子組成的環形封閉囊泡，無毒無免疫原性，使用方便.一些陽離子脂質體更被認為有應用前景［16］ ，因為這些陽離子脂質體一方面可以通過離子吸附方式結合帶陰離子的DNA，ODN分子，另一方面又能與細胞作用，通過融合、內吞等方式將所攜帶的DNA或ODN分子送入細胞.

我們觀察了應用人工合成的TGF-α反義ODN對人大腸癌細胞株HR8348的作用.結果表明，TGF-α反義ODN能抑制HR8348的細胞生長增殖和DNA合成，抑制了其在裸鼠體內形成腫瘤的能力.本研究對大腸癌發生機制的探討和大腸癌的基因治療有一定的理論意義和潛在的應用價值.

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