摘 要:目的 研究用轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）反義脫氧寡核苷酸（ASODN）對人大腸癌細(xì)胞株HR8348生長增殖的作用，探討大腸癌治療的新途徑. 方法 采用人工合成的TGF-α反義及無關(guān)對照ODN經(jīng)陽離子脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染人大腸癌HR8348細(xì)胞.采用MTT法，［3 H］-TdR摻入實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期分析，裸鼠體內(nèi)接種等方法測定瘤細(xì)胞體內(nèi)外增殖的變化. 結(jié)果 經(jīng)TGF-α反義ODN處理的HR8348細(xì)胞與對照組HR8348細(xì)胞相比，體外增殖速度減慢（細(xì)胞增殖抑制率達(dá)71%），DNA合成受抑，裸鼠體內(nèi)成瘤率下降（25%vs100%）. 結(jié)論 TGF-α反義ODN能有效抑制大腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長增殖，可用于實(shí)驗(yàn)性腫瘤基因治療研究.

Keywords:colorectal neoplasms;transforming growth factorα;oligodeoxynucleotides;cell line;liposome

Abstract:AIM To investigate the effects of TGF-αanti-sense oligodeoxynucleotides（ASODN）on human rectal carci-noma cell line HR8348.METHODS Cationic liposome and lipofectamine were selected as a delivery vector.HR8348cells were treated with ASODN in vitro.HR8348cells with or without pretreatment were inoculated into nude mice.RE┐SULTS Proliferation and DNA synthesis of HR8348cells treated with ASODN were greatly inhibited and tumorigenic rate was greatly reduced.CONCLUSION TGF-αASODN could inhibit the proliferation of human colon cancer cell line in vitro as well as in vivo.The results implicate the potential value in colorectal cancer gene therapy.

0 引言

轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）在多種腫瘤中的過表達(dá)促進(jìn)了瘤細(xì)胞的增殖、分裂，并與腫瘤的惡性表性有關(guān)

［1］ ，有報(bào)道稱大腸癌組織中也存在TGF-α的高表達(dá)［2，3］ .我們在查明HR8348細(xì)胞系存在TGF-α高表達(dá)后，用TGF-α反義脫氧寡核苷酸（ASODN）對其進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，研究該反義脫氧寡核苷酸對該細(xì)胞系細(xì)胞生長的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 材料 人大腸癌細(xì)胞株HR8348來源于1例男性直腸腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供，培養(yǎng)在含100mL?L-1 小牛血清的RPMI1640（Gibco公司）培養(yǎng)液，37℃，50mL?L-1 CO2 的環(huán)境中.

1.2 合成硫代寡脫氧核苷酸 TGF-α反義脫氧寡核苷酸（ASODN）由18個(gè)堿基組成，與TGF-αcDNA前3個(gè)密碼子及其上游部位3個(gè)密碼子堿基序列互補(bǔ).反義鏈序列為5’-GGGGACCATTTTACGG-GC-3’;無關(guān)對照寡聚核苷酸（N-ODN）由18個(gè)堿基隨機(jī)組合，序列為5’-GCTAGGATCTGGAGCTCG-3’，經(jīng)基因庫檢索不與已有的已知編碼序列相互補(bǔ).以上ODN均用硫代磷酸修飾，由本校生物化學(xué)教研室合成.

1.3 脂質(zhì)體┐ODN復(fù)合物的制備 陽離子脂質(zhì)體LipofectAMINE［4］ 購自Gibco公司，制備前將ODN稀釋于0.1mL無血清無抗生素的RPMI1640中，加入同樣方法稀釋的脂質(zhì)體，混勻，室溫放置5～10min，即可形成脂質(zhì)體-ODN復(fù)合物并立即用于細(xì)胞處理.脂質(zhì)體與ODN用量參考說明書.

1.4 細(xì)胞處理 用無血清無抗生素的RPMI1640稀釋HR8348細(xì)胞，接種0.8mL細(xì)胞（約1.5×106 個(gè)）于35mm培養(yǎng)皿.將脂質(zhì)體ODN復(fù)合物（0.2mL）加入培養(yǎng)皿，充分混勻，添加4mL含血清RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)48h，而后收集細(xì)胞.

1.5 ODN對HR8348細(xì)胞生長增殖的影響 采用MTT法及［3 H］-TdR摻入試驗(yàn).取對數(shù)生長期細(xì)胞用無血清無抗生素RPMI1640稀釋，接種40μL細(xì)胞（約1×104 個(gè)）于96孔培養(yǎng)板，加入脂質(zhì)體-ODN復(fù)合物，充分混合，培養(yǎng)5h后，添加200μL含血清RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)48h.而后吸棄上清，以RPMI1640清洗兩遍，加入RPMI1640液200μL，MTT（5g?L-1 ）20μL，37℃培養(yǎng)4h后吸棄上清液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）200μL，振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測其吸光度，每組復(fù)設(shè)3孔，取均值.設(shè)空白對照、陰性對照各1組.另1個(gè)96孔板中同上加入細(xì)胞及脂質(zhì)體-ODN復(fù)合物，培養(yǎng)5h后添加200μL含血清RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)24h，向培養(yǎng)液中加入［3 H］-TdR，培養(yǎng)24h后按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行測定.

1.6 脂質(zhì)體為載體對ASODN作用效率的影響 用3’末端標(biāo)記法將［α-35 S］標(biāo)記到ASODN上.將細(xì)胞（2×10

5 ?mL-1 ）鋪種于24孔培養(yǎng)板，加入脂質(zhì)體包裝與未包裝的［α-35 S］ASODN，終濃度為10μmol?L-1 ，置37℃50mL?L-1 CO2 孵箱中培養(yǎng).分別于24，48和72h取出細(xì)胞，以PBS洗滌，至上清液放射計(jì)數(shù)為0.測定細(xì)胞中［α-35 S］的放射活性.

1.7 細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)分析 將處理細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，制成1×104 ?L-1 細(xì)胞懸液，碘化丙啶（PI）染色，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀測定.

1.8 裸鼠致瘤能力試驗(yàn) 裸鼠11只分成試驗(yàn)組、空白組、陰性對照組，分別為4，3和4只，每只于皮下注射1×107 細(xì)胞.

2 結(jié)果

2.1 ODN對HR8348細(xì)胞DNA合成及生長增殖的抑制 TGF-α反義ODN能抑制HR8348細(xì)胞的DNA合成及生長增殖.與空白對照組相比，腫瘤細(xì)胞生長增殖的抑制率為71%，［3 H］-TdR摻入實(shí)驗(yàn)的抑制率為73%.而經(jīng)無關(guān)對照ODN處理的陰性對照組對HR8348細(xì)胞的生長增殖以及DNA合成無 顯著抑制.

2.2 HR8348細(xì)胞對［α┐35 S］ASODN的攝入 結(jié)果表明，細(xì)胞對脂質(zhì)體包裝組的［α-35 S］攝入量明顯高于未包裝組，這種差別隨時(shí)間延長而更加顯著（Tab1）.

表1 HR8348細(xì)胞對［α-35 S］ASODN的攝入略

2.3 細(xì)胞周期分析 TGF-α反義ODN作用于HR8348后，細(xì)胞G0 /G1 期細(xì)胞數(shù)明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)相應(yīng)減少，而G2 +M期細(xì)胞數(shù)亦明顯的減少，而無關(guān)ODN組作用明顯減弱，差異明顯（Tab2）. 表2 不同處理HR8348細(xì)胞周期分析略

2.4 裸鼠皮下移植瘤生長 空白對照組3只及陰性對照組4只所有接種部位均有移植瘤形成且腫瘤體積大，成瘤率為100%（3/3，4/4），TGF-α反義ODN處理4只，成瘤率低下（25%，1/4），且移植瘤生長緩慢，瘤體小（Tab3）.

表3 ASODN對HR8348細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤形成的影響略

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對癌基因、生長因子及生長因子受體研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到生長因子及其受體在介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖轉(zhuǎn)化中占有重要地位.促瘤形成的自分泌和旁分泌機(jī)制的提出，促進(jìn)了腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入研究.有許多證據(jù)證明TGF-α在腫瘤細(xì)胞的惡性增殖中起一定作用，在許多惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有TGF-α的過度表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌［2］ 及前列腺癌等，TGF-α可與EGFR結(jié)合而激活受體的酪氨酸酶活性，從而啟動(dòng)細(xì)胞有絲分裂，引起及誘導(dǎo)血管形成和腫瘤生長.已有實(shí)驗(yàn)證明，TGF-α可以通過自分泌機(jī)制在細(xì)胞的癌變中起一定作用［6-10］ .

本結(jié)果顯示，TGF-α反義ODN對人大腸癌細(xì)胞株HR8348的生長增殖和DNA合成均有抑制作用，經(jīng)TGF-α反義ODN處理后的腫瘤細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)致瘤能力明顯下降，而經(jīng)無關(guān)對照的ODN處理后的腫瘤細(xì)胞無此抑制作用，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞周期分析結(jié)果也表明，經(jīng)TGF-α反義ODN處理的腫瘤細(xì)胞生長明顯被阻滯于G0 /G1 期，增殖指數(shù)（proliferation Index，PI）明顯低于其他兩組對照組，表明TGF-α反義ODN可阻抑TGF-α與EGFR激活后所促發(fā)的細(xì)胞向S期過渡及由此導(dǎo)致的細(xì)胞過度增殖.TGF-α反義ODN對TGF-α的抑制機(jī)制可能為:①直接與TGF-α的mRNA結(jié)合誘發(fā)內(nèi)源性核酸酶對雜交體中RNA部分的水解;②封閉酶結(jié)合位點(diǎn);③阻斷前mRNA的剪切;④與雙鏈DNA的某一段特異性結(jié)合，形成三螺旋結(jié)構(gòu)［11-15］ .

脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子組成的環(huán)形封閉囊泡，無毒無免疫原性，使用方便.一些陽離子脂質(zhì)體更被認(rèn)為有應(yīng)用前景［16］ ，因?yàn)檫@些陽離子脂質(zhì)體一方面可以通過離子吸附方式結(jié)合帶陰離子的DNA，ODN分子，另一方面又能與細(xì)胞作用，通過融合、內(nèi)吞等方式將所攜帶的DNA或ODN分子送入細(xì)胞.

我們觀察了應(yīng)用人工合成的TGF-α反義ODN對人大腸癌細(xì)胞株HR8348的作用.結(jié)果表明，TGF-α反義ODN能抑制HR8348的細(xì)胞生長增殖和DNA合成，抑制了其在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力.本研究對大腸癌發(fā)生機(jī)制的探討和大腸癌的基因治療有一定的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值.

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