作者：楊向民，邢金良，姚西英，張思河，陳志南

【關鍵詞】 結直腸腫瘤 【Abstract】 AIM: To identify and express the Fab Fragment against human colorectal cancer in E.coli by cloning the Fab genes of the mAb CAb1. METHODS: Light chain and Fd fragments of MAb CAb1 were amplified by RTPCR and PCR products were sequenced and analyzed after being cloned into pMD18T vector. The expression vector FdL/pComb3 was obtained after subcloning light chain and Fd fragment gene into pComb3 and deleting the gⅢ gene. Then the vector FdL/pComb3 was transformed into XL1Blue E.coli strain and induced by IPTG. The specificity of the expression products was detected by ELISA and immunofluorescence staining methods. RESULTS: The Fab gene of MAb CAb1 was cloned and expressed in E.coli. The expression product CAb1 Fab possessed the activity to combine with cell strain SW480. CONCLUSION: We successfully construct an expression vector FdL/pComb3 to express monovalent Fab against human colorectal cancer. 【Keywords】 colorectal neoplasms; Fab genes; clone; expression 【摘要】 目的：從雜交瘤細胞中克隆mAb CAb1所編碼Fab抗體基因，并在大腸桿菌中進行表達和鑒定. 方法：采用RTPCR方法，擴增mAb CAb1的Fd片段和全長κ鏈基因，分別克隆到T載體后進行序列測定和分析. 依次亞克隆兩個基因到噬粒pComb3中，去除該載體上的gIII基因，構建成分泌表達載體FdL/pComb3. 轉化XL1Blue E.coli菌株，IPTG誘導表達. 采用ELISA和免疫熒光法檢測表達產物的特異性. 結果：克隆了大腸癌mAb CAb1的Fab基因，并在E.coli中獲得表達. 產物CAb1 Fab具有與大腸癌細胞株SW480特異結合的活性. 結論：成功構建了在E.coli中表達抗人大腸癌mAb CAb1的小分子單價Fab抗體的載體. 【關鍵詞】 結直腸腫瘤； Fab抗體；克?。槐磉_ 0引言 我國大腸癌發病率有增高的趨勢［1］. 隨著工程抗體技術的發展，mAb用于大腸癌的診治獲得了較大的進展. 采用放射性核素標記Fab抗體可使核素很好地在腫瘤組織濃聚，減少藥物的毒副作用，為早期微小病灶和腫瘤的復發和轉移治療提供了有效的手段［2］. 因此我們通過對已制備的雜交瘤細胞株mAb CAb1的Fab基因進行克隆、表達和鑒定如下. 1材料和方法 1.1材料 雜交瘤細胞株［3］、表達載體pComb3及E.coli感受態菌株JM109和XL1Blue均為本室保存. Trizol為Gibco公司產品. cDNA第一鏈合成試劑盒購自Promega公司. TA克隆試劑盒、PCR試劑盒及限制性內切酶和連接酶，均為Takara產品. IPTG，FITC和HRP標記的羊抗鼠IgG購于華美公司. 1.2方法 收集處于對數生長期的CAb1雜交瘤細胞1×107，應用Trizol試劑提取總RNA，具體步驟參照試劑說明書進行. 最后一步選用100 μL DEPC處理的ddH2O溶解RNA，紫外法測定總RNA的濃度，甲醛變性電泳觀察. 所余樣品置于-70℃保存備用. 寡核苷酸引物設計參照文獻［4］，設計克隆Fab基因的PCR引物，由上海申友公司合成. 用于擴增鼠κ輕鏈的PCR引物共6條：MKV1 5′GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT3′; MKV2 5′GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3′; MKV3 5′GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA3′; MKV4 5′GGGGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT3′; MKV5 5′GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG3′; MKC 5′GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA3′. 用于克隆鼠重鏈Fd的PCR引物5條：MHV 1 5′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′; MHV 2 5′GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT3′; MHV 3 5′GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT3′; MHFR1 5′AGGT（GC）(AC)A(GA)CT(GT)CTCGAGTC(AT)GG3′; MHCG1 3′5′AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT3′. 用于剔除輕鏈假基因和構建FdL/pComb3基因的特異引物pseudoCDR1 5′TCTGGCTATAGTTATATGCAC3′; pseudoCDR3 5′TGTAAGCTCCCTAATGTGCTG3′; MKVBACK 5′GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC3′. 其中，劃線處為限制性酶切位點， 依次為：EcoRⅤ， SacⅠ， XbaⅠ， XhoⅠ， SpeⅠ. 1.2.1CAb1 Fab基因的克隆cDNA反轉錄體系：總RNA (2 μL) 1 μg，隨機引物Oligo(dT)15 0.5 μg (1 μL)， MgCl2 (25 mmol/L) 4 μL， 5×dNTPs 2 μL， 10×緩沖液2 μL， RNase抑制劑0.5 μL，反轉錄酶AMV 15 U（0.75 μL），用水補至20 μL，其余步驟參見試劑盒進行. 取cDNA 2 μL為模板，用相應的配對引物擴增全長輕鏈和Fd基因，其余步驟參照PCR試劑盒說明書. 對輕鏈基因PCR產物，用引物pseudoCDR1，3進行PCR鑒定. 將輕鏈和Fd基因與pMD18T載體連接，轉化JM109感受態細胞，獲得克隆載體pMD18T/Fd和pMD18T/L. 對上述載體進行序列測定和分析. 選用NCBI和IMGT數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/；http://imgt.cines.fr:8104/cgibin/IMGTdnap.jv）進行結果分析. 1.2.2CAb1 Fab基因表達載體的構建選用引物MKVBACK和MKC，以pMD18T/L為模板，進行輕鏈的擴增（去掉肽部分，并引入正確的酶切位點），純化定量后，選用Sac I+Xba I消化與雙酶切的pComb3連接，轉化并篩選鑒定. 然后，用Xho I+Spe I雙酶切pMD18T/Fd，亞克隆Fd至pComb3/L，獲得展示型載體pComb3/FdgIIIL，以Spe I+Nhe I酶切gIII，用T4 DNA連接酶將其環化為分泌型的表達載體FdL/pComb3. 1.2.3Fab基因的表達及鑒定挑取含FdL/pComb3單菌落，接種于5 mL 2×YTAG（含Amp 100 mg/L，2 g/L glucose）30℃過夜培養. 次日1%轉接種于2×YTAG中，至A600 nm為0.8，5000 r/min離心10 min，棄上清，用2×YTI 200 mL (含Amp 100 mg/L，IPTG 0.8 mmol/L) 重懸菌體，30℃ 誘導培養24 h. 收集菌體，用適量PBS重懸，反復凍融，離心收集上清，過0.45 μm濾膜后，4℃保存備檢. 以羊抗鼠IgG（10 mg/L）包被ELISA板，加50 g/L脫脂奶粉37℃封閉1 h，加入誘導空菌XL1Blue和FdL/pComb3轉化未誘導菌及誘導菌的凍融離心上清50 μL，PBS作為空白對照. 加入HRP羊抗鼠IgG后，以TMB為底物顯色，檢測A450 nm值.