作者：孫海波 李靜 安鼎偉 陳麗 張照果

【摘要】 目的 探討RNA干擾(RNAi)技術沉默STAT3基因表達對人大腸癌細胞生物學行為的影響。方法 采用真核細胞轉染技術將pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質粒轉染人結腸癌HCT116細胞，MTT法檢測細胞增殖，RTPCR、Western blot及免疫組化法分別觀察STAT3基因和蛋白的變化，流式細胞儀及AO/EB染色觀察細胞凋亡。結果 pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質粒對大腸癌細胞的增殖有明顯抑制作用，與空白組及陰性組相比差異有統計學意義(P<0.05);在重組質粒組，STAT3基因mRNA及蛋白的表達與空白組及陰性組相比明顯減低(P<0.05);重組質粒可誘導HCT116細胞凋亡，細胞周期分期示細胞阻滯于G2期。結論 pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質粒可抑制STAT3基因在人大腸癌細胞中的表達。

【關鍵詞】 STAT3;RNA干擾;大腸癌;基因治療

大腸癌發生發展過程受諸多因素的影響〔1〕。傳統的放療、化療及手術治療仍不能獲得理想的效果，而基因治療逐漸成為大腸癌研究的熱點。轉錄信號傳導子與激活子家族(signal transducers and activators of transcription，STAT)的重要成員STAT3，其信號傳導通路與細胞的增殖、分化及凋亡密切相關，該通路持續激活可導致細胞異常增殖和惡性轉化，目前將其定義為癌基因〔2〕。本文通過RNA干擾(RNAi)技術抑制STAT3基因在人大腸癌細胞HCT116中的表達，觀察其對大腸癌細胞生物學行為的影響，為大腸癌基因治療提供有效靶點及技術。

1 材料與方法

1.1 材料 AntipSTAT3(Y705)、βactin兔抗人多克隆抗體購自cst公司。人結腸癌HCT116細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。轉染試劑siPORT NeoFX購于Ambion公司，IMDM、胎牛血清購自Gibco公司，常規試劑由遼寧醫學院科學實驗中心提供。pSilencer1.0U6STAT3siRNAGFP重組質粒由本室保存，超純質粒小樣快速提取試劑盒(去內毒素)購于EZNA公司，質粒提取按說明書進行，經λDNA定量0.5 g/L者待用。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 取對數生長期細胞，轉染前1 h，0.25%胰酶消化后，含10%胎牛血清的IMEM培養基終止消化，收集備用。實驗分為空白組(M)，pSH1SiScramble組(N)，pSH1SiSTAT3組(T)，T組再按質粒濃度分為T1、T2、T3。每組分24 h、48 h、72 h三個時間段，每時間段 4復孔。各組質粒分別取：N組0.8 μg，T1組0.6 μg，T2組0.8 μg，T3組1.2 μg加染試劑2.0 μl，于24 h、48 h、72 h相差顯微鏡下觀察拍照后，各孔加入5 g/L的MTT 20 μl，孵育4 h，棄上清，每孔加入分析純DMSO 100 μl，震蕩10 min，酶標儀檢測各孔吸光度值(A570)，計算細胞生長抑制率。實驗共重復3次。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.2.2 細胞轉染 轉染前1 h，按上述方法收集細胞備用。實驗分為M、N、T共3組。將轉染試劑5.0 μl溶于終體積IMDM(17.7 g/L)100 μl，混勻后制成A液，室溫孵化10 min;各組質粒分別取3.0 μg溶于IMDM(17.7 g/L)100 μl，混勻后制成B液;將A液加入B液，混勻后制成C液，室溫孵化10 min。分配C液200 μl到6孔板各孔中，調細胞濃度為2×105/孔。轉染后72 h，相差顯微鏡觀察細胞生長情況后進行后續實驗。

1.2.3 RT-PCR 收獲的細胞按說明書完成RNA提取，取總RNA 10 μg逆轉錄為cDNA，PCR條件:94℃，5 min;94℃，30 s;56℃，30 s;72℃，45 s;72℃，7 min，30循環，25 μl體系，以βactin為內參。PCR產物以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Gene genius凝膠成像系統分析后，以STAT3/βactin產物量的比值為最終結果。實驗重復3次。引物序列:STAT3：正向5′TTGCCAGTTGTGGTGATC3′，反向5′AGACCCAGAAGGAGAAGC3′;βactin:正向5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′，反向5′ATGCTATCACCTCCCCTGTG3′。

1.2.4 Western印跡法 收獲的細胞，加入裂解液，超聲裂解20 s，冰上靜置30 min，12 000 r/min 4℃離心25 min，上清為總蛋白粗提液。BCA法蛋白定量，取總蛋白40 μg/20 μl，煮沸變性5 min，SDSPAGE電泳后半干法轉膜至PVDF膜，AntiPSTAT3及βactin兔抗人多克隆抗體濃度為1∶1 000，堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗濃度為1∶1 000，NBT/BCIP 顯色。Gene genius凝膠成像系統分析后，以STAT3/βactin蛋白量的比值為最終結果。實驗共重復3次。

1.2.5 細胞免疫組化法 按上述轉染步驟將細胞分M、N、T共3組轉染于6孔板內，72 h后取出蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察拍照后用40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗3次，蒸餾水洗3次，TritonX 100(0.3%)洗10 min，PBS洗5 min×3次，其余步驟按免疫組織化學染色說明書操作。陽性結果為細胞質或胞核棕黃著色，隨機選取5個高倍鏡視野，計數陽性細胞占所研究細胞的15%以上即為陽性。

1.2.6 流式細胞術(FCM) 取轉染48 h后的細胞1×106個，離心后用冷PBS懸浮，1 000 r/min離心10 min，清洗2遍，棄上清，將細胞用1 ml注射器快速推入700 ml/L冷乙醇中，4℃固定12 h以上。PBS洗2次，調細胞密度為1×109/L，RNase消化后，加入50 mg/L 1.5 ml PI染液。混勻后上流式細胞儀做單參數分析，計算各期細胞所占比例，實驗共重復3次。

1.2.7 AO/EB雙染色 取轉染72 h后的細胞，制成懸液并調細胞密度為1×1010/L，取20 μl加100 mg AO染液2 μl及100 mg EB染液2 μl，滴于載玻片，蓋片封片后熒光顯微鏡直接觀察，于20 min內計數500個細胞。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0軟件行相關數據分析，計量資料采用x±s表示;兩組均數的比較用t檢驗。

2 結 果

2.1 細胞增殖活性判定 參照轉染試劑說明書推薦的質粒最佳轉染濃度，設計3種不同濃度(0.015 g/L、0.020 g/L、0.030 g/L)的pSH1SiSTAT3，結果顯示細胞增殖活性隨質粒濃度增高而下降，但在0.020 g/L和0.030 g/L濃度之間變化不大，故選擇0.020 g/L作為最佳質粒濃度進行以后的實驗。MTT結果顯示，N組細胞生長速度略慢于M組，T組細胞生長明顯慢于M組及N組，生長抑制率24、48、72 h分別為13.32%、35.44%、 44.14%，48 h及72 h組與M組細胞相比均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 HCT116細胞STAT3表達 RTPCR結果顯示，T組STAT3基因的mRNA表達明顯降低，STAT3產物量/βactin的比值分別為0.866±0.03、0.853±0.02、0.453±0.03，T組與M組、N組相比均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。Western印跡結果顯示，重組質粒治療組PSTAT3蛋白表達亦明顯減弱，STAT3蛋白量/βactin分別為0.780±0.01、0.713±0.01、0.430±0.01，有統計學意義(P<0.05)，見圖2。細胞免疫組化結果顯示，M組及N組胞漿和/或胞核中可見大量棕黃著色細胞，而T組僅見部分細胞核中含有棕黃色顆粒。表1 不同處理組HCT116細胞吸光度A值比較圖1 不同處理組HCT116細胞STAT3基因mRNA表達

2.3 大腸癌HCT116細胞凋亡 FCM結果示T組細胞出現明顯的細胞凋亡峰，凋亡率達20.6%，與M組及N組相比有統計學意義(P<0.05)。細胞周期分析示T組細胞出現G2期阻滯，T組S期與G2期細胞數與M組及N組相比有統計學意義(P<0.05)，見表2。AO/EB雙染色結果M組及N組細胞呈綠色或黃綠色熒光，T組細胞可見較多黃色熒光，偶見紅色熒光，提示實驗組細胞較多呈早中期凋亡。見圖3。圖2 不同處理組HCT116 STAT3蛋白Western印跡表2 不同處理組HCT116細胞凋亡率及細胞周期分布圖3 不同處理組HCT116細胞AO/EB雙染色(熒光顯微鏡，×400)

3 討 論

STAT3是作為白細胞介素6(IL6)信號傳遞中的急性反應因子最早被發現并被純化的〔3〕，其所參與的JAK/STAT信號傳導通路與細胞的增殖、分化及凋亡密切相關，該通路持續激活可導致細胞異常增殖和惡性轉化，為腫瘤形成過程中的重要環節〔2，4，5〕。Joshua等〔6〕研究表明，STATs所介導的JAK/STAT信號轉導通路在大腸癌的發生、發展中起重要作用。我們的前期研究亦證實在42例人大腸癌組織及癌旁組織中均有STAT3mRNA及蛋白的高表達，同時檢測的下游基因cmyc、survivin及VEGF基因在大腸癌及癌旁組織中的表達亦增高，p53基因降低，提示STAT3的異常激活在大腸癌的發生和發展過程中起重要的促進作用并阻斷了某些重要抑癌基因的活性〔7〕，因而STAT3基因可望成為大腸癌治療的新靶點。

RNAi是近年發現的一種重要的轉錄后水平的基因沉默方式〔8〕。并以其高效性、高特異性等優點而作為研究基因功能的一種重要和常用的技術，已廣泛用于基因研究和臨床疾病尤其是腫瘤的治療研究，有廣闊的前景和應用潛力。Zheng等用RNAi技術在人胰腺癌SW1990細胞中成功的抑制了STAT3的表達，為防止胰腺癌的侵襲和轉移提供了新的策略〔9〕。本研究應用針對人的STAT3基因的siRNA構建表達載體pSilencer3.0U6STAT3siRNAGFP，轉染過度表達STAT3基因的人大腸癌細胞株HCT116，結果表明重組質粒在mRNA及蛋白水平均可抑制STAT3基因表達，MTT結果亦表明T組HCT116細胞的增殖活性明顯減低，可見RNAi可使大腸癌HCT116細胞的生物學行為明顯受抑，為大腸癌的基因治療提供了可靠的依據。此外，應用RNAi沉默STAT3基因后，S期細胞所占比例明顯減少而阻滯于G2期的細胞增加，凋亡細胞所占百分率明顯增加，這與Kunigal等〔5〕在乳腺癌中的研究相似。表明RNAi抑制STAT3基因可促進HCT116細胞凋亡，有助于抑制大腸癌的侵襲和轉移并指導診療。我們在本研究中還發現N組的細胞在轉染后出現部分細胞形態改變， mRNA及蛋白表達也有變化，雖然與M組相比無顯著性差異，但提示轉染試劑及攜有無關序列的表達載體對細胞還是存在一定的毒性作用及脫靶效應，如能有效克服，將使以siRNA為主的基因重組藥物發揮更理想的治療作用。

因此，應用RNAi技術可抑制STAT3基因在大腸癌細胞中的表達，人工合成的STAT3siRNAGFP可通過抑制大腸癌細胞的增殖、促進大腸癌細胞的凋亡而發揮抗腫瘤作用，STAT3基因可成為大腸癌治療中重要的靶點。