作者：鮑嵐焦西英程希平張旭

【關鍵詞】 熒光抗體技術

關鍵詞: 熒光抗體技術;激光;顯微鏡檢查

0 引言

免疫組織化學方法是對細胞及細胞內的某種抗原物質進行定性、定位或定量檢測的方法.隨著標記技術的不斷改進，使得免疫組織化學方法檢測的敏感性大大增強;隨著顯微鏡技術的發展，且與計算機技術的不斷結合，可以對抗原物質作更加精確和全面的定位.我們應用酪氨信號放大間接免疫熒光組織化學方法，并結合激光共聚焦顯微鏡術對腦動脈Y1 受體免疫反應物質分布進行了觀察.

1 材料和方法

1.1 酪氨信號放大間接免疫熒光組織化學方法 11只SD大鼠（200～250g），戊巴比妥鈉（50mg?kg-1 ，ip）麻醉，經心臟灌注37℃生理鹽水50mL和37℃的40g?L-1 多聚甲醛和2g?L-1 苦味酸磷酸緩沖固定液50mL，再灌注4℃同樣固定液250mL，取大鼠全腦，在同樣固定液中后固定1.5h，200g?L-1 蔗糖浸泡24h以上.4只大鼠分離其腦底部表面腦動脈，盡可能分離到最細的分支，有大腦前動脈、大腦前內動脈、大腦中動脈、頸內動脈、大腦后動脈、小腦上動脈、基底動脈和椎動脈及其分支;從其他3只大鼠片下腦底部的表層腦組織，其中含有完整的腦表面血管網.

根據酪氨信號放大間接免疫熒光組織化學方法，對大鼠剝離的腦底部表面分離的腦動脈和片下的有腦表面血管網的表層腦組織進行組織處理.第一抗體為針對Y1 受體C末端肽片段（氨基酸序列為355～382）的純化兔抗血清（1∶8000）［1］ .使用Dupont NEN TSA-Indirect Tyramide Signal Amplification Kit（Dupont，NEN Research Products，Boston，MA.USA），具體步驟如下:在TNB緩沖液中封閉切片30min，室溫（腦表面組織片為60min）↓在濕盒內將組織用第一抗體孵育1d，4℃（腦表面組織片為3d）↓TNT緩沖液洗15min（3×5min），室溫（腦表面組織片為30min）↓在濕盒內將切片置于HRP標記的豬抗兔IgG中（1∶100）孵育30min，室溫（腦表面組織片為1∶200，60min）↓用TNT緩沖液洗15min（3×5min），室溫（腦表面組織片為30min）↓在濕盒中用Biotinyl Tyramide（1∶50）孵育3～10min，室溫（腦表面組織片為1∶100，30min）↓用TNT緩沖液洗15min（3×5min），室溫（腦表面組織片為30min）↓在濕盒中用Streptavidin fluorescence孵育30min（TNB配制），37℃（腦表面組織片為60min）↓用TNT緩沖液洗15min（3×5min），室溫（腦表面組織片為30min）↓封片

注:TNT緩沖液為:0.1mol?L-1 Tris-HCl（pH7.5），0.15mol?L-1 NaCl，0.5mL?L-1 TWEEN20;TNB緩沖液為:0.1mol?L-1 Tris-HCl（pH7.5），0.15mol?L-1 NaCl，0.5g?L-1 DuPont Blocking Reagent.

1.2 激光共聚焦顯微鏡術 用Bio-Rad MRC-600激光共聚焦顯微鏡觀察組織切片，激發光波長為488nm，觀察異硫氰酸熒光素（FITC）標記的Y1 受體-LI.在觀察分離腦血管和片下的腦表層組織時，使用激光共聚焦顯微鏡特有的功能“光學切片（optic section）”.特別是在觀察腦表面動脈時，將凹凸不平的腦組織的最上面定為零平面，由此平面向下每隔5μm得到一幅圖像（切片），隨腦表面起伏向下50～100μm，得到10～20幅圖像，將這些圖像在原位進行疊加，得到一幅各個平面都聚焦清楚的疊加的圖像，避免了厚片聚焦不清的缺點，在一張疊加圖片上形成被掃描區域內完整的腦表面血管中Y1 受體的免疫反應陽性標記. 2 結果

在分離的各級動脈中均可見Y1 受體免疫反應陽性和Y1 受體免疫反應陰性平滑肌細胞呈不規則間隔地出現，這樣的間隔分布特征在激光共聚焦顯微鏡下更加明顯（圖1a），同時觀察到Y1 受體免疫反應陽性物質主要存在于靠近血管外膜面的平滑肌細胞膜附近的細胞質中，血管中兩個平滑肌細胞側面相鄰面的細胞膜附近的細胞質中Y1 受體免疫反應陽性標記強度也較高（圖1b）.

片下的腦表面組織的激光共聚焦顯微鏡分析表明:Y1 受體免疫反應陽性強標記分布在腦底表面直徑為15～30μm的微動脈，主要為中動脈、前和后動脈的第2、3級分支及直接從基底動脈發出的小分支，免疫染色的強度隨動脈管徑進一步變小直徑（<10μm）而下降，沿著主要動脈的第2級分支可觀察到弱的Y1 受體免疫反應陽性標記（圖2）.

圖1 － 圖2 略

3 討論

在研究Y1 受體在腦動脈中的分布時用了TSA免疫熒光組織化學方法，這種方法是在原有的免疫熒光組織化學方法的基礎上，中間增加了兩步信號放大過程，即HRP標記的豬抗兔IgG和生物素化的酪氨的孵育過程，提高了檢測的敏感性.但有時也同時提高了熒光背底的強度，因此在原本免疫熒光標記背底較高的組織，如心臟組織則不能用此方法.

在本研究中應用了激光共聚焦顯微鏡技術，由于激光共聚焦顯微鏡的高分辨率，在觀察細胞時所能看到的結構介于普通的光學顯微鏡和電子顯微鏡之間，但它仍然不能區分各種細胞器.由于激光共聚焦顯微鏡的高分辨率與計算機技術的結合，賦予了顯微鏡一些特殊的功能，如“光學切片”等，可以在普通顯微鏡無法很好觀察或根本無法觀察時，得到很好的圖像，如在本實驗中由于腦表面高低不平，很難觀察完整的腦血管系統中Y1 受體免疫反應陽性標記在腦動脈中分布情況，我們用激光共聚焦顯微鏡可以做連續掃描，采用“光學切片”的特點，將數十張“光學切片”疊加，形成完整的腦表面血管分布圖，得到了非常好的研究結果.同時，用激光共聚焦顯微鏡來分析Y1 受體免疫反應陽性物質在血管平滑肌內的分布，可以更為整體地闡明Y1 受體免疫反應陽性物質在細胞內的區域性分布特征.

［1］Zhang X，Bao L，Xu ZQ etal.Localization of neuropeptide Y Y1 receptors in the rat nervous system with special reference to so-matic receptors on small dorsal root ganglion neurons ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91（24）:11738-11742.