作者：馮艷銘馬俊芬吳飚郭蘭英吳擁軍李智濤吳逸明

【摘要】 目的： 建立檢測(cè)甲胎蛋白化學(xué)發(fā)光免疫定量分析方法. 方法： 采用雙抗體異位點(diǎn)一步夾心法，以甲胎蛋白單克隆抗體作為固相包被，采用改良過碘酸鈉法進(jìn)行甲胎蛋白多克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗體；以金剛烷胺衍生物CSPD作為底物，優(yōu)化CSPD與SapphireII發(fā)光體系；用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品校定定量標(biāo)準(zhǔn)品，建立了人血清AFP的化學(xué)發(fā)光免疫定量分析法. 用該法檢測(cè)800份正常人血清，確定正常值參考范圍，將臨床血清標(biāo)本100份與bayer Acs: 180全自動(dòng)發(fā)光體系統(tǒng)進(jìn)行比較. 結(jié)果： 本方法的最低檢出量為2.0 ng /mL，線性范圍2.0~600.0 ng/mL，批內(nèi)和批間的變異率分別為6.7%和7.7%，回收率在98.2%~102.5%之間. 與CEA(3 μg/mL)的交叉≤0.15%；與鐵蛋白(10 μg /mL) ≤0.04%；與人血清白蛋白（200 g/L）≤2.5×10-8，與人血清丙球蛋白（100 g/L）≤2.0×10-8，與bayer Acs:180比較相關(guān)系數(shù)r=0.994（P<0.001）. 結(jié)論： 建立的甲胎蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析法可常規(guī)用于臨床檢測(cè). 【關(guān)鍵詞】 甲胎蛋白類；化學(xué)發(fā)光測(cè)定法；定量分析 【Abstract】 AIM: To establish a method of chemiluminescent immunoassay for determination of alpha fetoprotein(AFP) in human serum. METHODS: The twosite enzyme immunoassay is based on the direct sandwich technique. A monoclonal antibody was bonded to the microplate for coating and the conjugation of alkaline phosphatase to another polyclonal antibody was performed by NaIO4 method. Chemiluminescent immunoassay was established by optimizing CSPD and SapphireII luminescent system. Sensitivity， linear scope， precision， interference and recovery for the method were evaluated. The reference range was defined by testing 800 serum samples from healthy subjects.The comparison for 100 serum samples from patients was assayed by the bayer Acs:180 Automated Immunoassay system. RESULTS: The detectable minimum was 2.0 ng/mL. The linear scope was from 2.0 to 600.0 ng/mL. Average inter and intraassay were 7.7% and 6.7%， respectively. The recoveries ranged from 98.2% to 102.5%. The crossreacting rate for CEA(3 μg/mL)， Ferritin(10 μg /ml)， HAS(200 g/L)， IgG(100 g/L) were≤0.15%， 0.04%， 2.5×10-8 and 2.0×10-8， respectively. Compared with bayer Acs:180 Automated immunoassay system， the relative coefficient was 0.994（P<0.001）. CONCLUSION: A successful establishment of chemiluminescent immunoassay provides a way for clinical determination of AFP. 【Keywords】 alphafetoproteins; chemiluminescent measurements; quanti tative analysis 0引言 甲胎蛋白（AFP）為最常用的腫瘤標(biāo)志物之一. 是目前最好的可實(shí)際用于早期診斷原發(fā)性肝癌的指標(biāo)，可在癥狀出現(xiàn)前6~12 mo作出診斷. 其他一些轉(zhuǎn)移性肝癌及肝外腫瘤如睪丸腫瘤， 卵巢腫瘤，胃癌，胰腺癌，結(jié)腸癌，支氣管癌，腎癌，乳腺癌和白血病等血液中的AFP也可增高. AFP屬糖蛋白，分子量70000，含糖40 g/L，正常人血清AFP含量在2~8 μg/L之間，AFP正常值一般低于25 μg/L;本文根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫分析法的原理建立并研制了甲胎蛋白化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下. 1材料和方法 1.1材料 抗AFP單抗腹水購(gòu)自O(shè)EM公司；AFP多克隆抗體為自制；AFP純品抗原購(gòu)自Fitzgeral公司；堿性磷酸酶（ALP）由華美生物工程公司提供；化學(xué)發(fā)光底物CSPD及增強(qiáng)劑購(gòu)自PE公司；過碘酸鈉（NaIO4）、硼氫化鈉（NaBH4）、乙二醇、2，4二硝基氟苯（DNFB）均購(gòu)自Sigma；Sephadex G200凝膠柱層析購(gòu)自LKB公司，DE52離子交換柱購(gòu)自Sigma，聚苯乙烯塑料白色不透明微孔板購(gòu)自深圳金燦華；luminescent化學(xué)發(fā)光儀（芬蘭雷勃）；洗板機(jī)（BioRad）；AFP國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所. 標(biāo)本均為血清，清亮無溶血，-20℃凍存. 分別為健康體檢門診的成年男性200份，成年女性（非妊娠女性）200份，青少年200份，老年人標(biāo)本200份，其中男女比例為1∶1；臨床標(biāo)本100份是陜西省人民醫(yī)院放免科采集的腫瘤或疑似患者血清. 1.2方法 1.2.1AFP單克隆抗體的純化抗AFP單抗腹水用500 g/L的飽和硫酸銨沉淀，再溶解透析后DE52換柱純化，分部收集，測(cè)定蛋白濃度. 蛋白濃度應(yīng)在4~10 g/L之間，無菌過濾，加1 g/L NaN3后分裝. -20℃存放. 1.2.2AFP多抗血清制備與純化純品AFP免疫健康雄性山羊，首次劑量0.5 mg/只. 4 wk后加強(qiáng)免疫，劑量減半，共加強(qiáng)免疫3次. 耳靜脈采血測(cè)定效價(jià)，雙擴(kuò)散效價(jià)>1∶128的羊，進(jìn)行心臟采血，分離血清，羊抗AFP血清按照1.3.1方法進(jìn)行純化. 1.2.3堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的制備采用改良過碘酸鈉乙二醇法進(jìn)行標(biāo)記［1］，將獲得的IgGALP用含100 g/L小牛血清的0.05 mol/L (pH 7.6)TBS緩沖液按1∶1000稀釋成工作液，保存于-20℃. 1.2.4AFP校準(zhǔn)品制備用系列國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定AFP純品抗原后，用AFP校準(zhǔn)品稀釋液稀釋成含量分別為0， 10， 25， 50， 15， 600 ng/mL系列濃度，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品做定量曲線進(jìn)行校準(zhǔn)品濃度測(cè)定、相關(guān)性分析，建立定量標(biāo)準(zhǔn)品. 1.2.5化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的優(yōu)化［2-3］由SapphireII不同濃度的增強(qiáng)劑和CSPD組成底物工作液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值（RLU）測(cè)定，進(jìn)行底物工作液的優(yōu)化. 1.2.6固相化抗體微孔板的制備［4］將抗AFP單抗用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋成1.0， 2.0， 5.0， 7.0， 10.0， 15.0 μg/mL的包被濃度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37℃封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度. 1.2.7正常人參考血清的確定用優(yōu)化好的AFP化學(xué)發(fā)光定量試劑對(duì)800份健康人標(biāo)本進(jìn)行濃度測(cè)定，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算x+2 S，確定正常血清參考范圍. 1.2.8化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)孔分別加25 μL后，每孔再各加抗AFPALP75 μL，在震蕩器上混勻1 min，置37℃恒溫反應(yīng)60 min. 洗掉游離成分，加入底物工作液50 μL，ALP催化底物脫磷酸酯，并發(fā)出463 nm的可見光，第10 min后測(cè)定各加樣品孔的發(fā)光值RLU，并將數(shù)據(jù)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀定量軟件Luminoskan Ascent version 2.4.1軟件進(jìn)行定量分析. 2結(jié)果 2.1底物工作液的優(yōu)化CSPD濃度為0.8， 0.4， 0.2， 0.1 mmol/L，SapphireII濃度為2.0， 1.0， 0.5， 0.25 g/L，分別用堿性磷酸酶1∶1000， 1∶10000在5， 10 min進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定，記錄不同增強(qiáng)劑和CSPD濃度的發(fā)光值，分別做出CSPD濃度RLU的曲線和SapphireIIRLU的曲線（圖1）. 分析上述數(shù)據(jù)可得出以下結(jié)論CSPD在0.4 mmol/L以下時(shí)，RLU隨CSPD濃度的變化而成比例變化，在0.4 mmol/L時(shí)達(dá)到平臺(tái)，可能是底物濃度在0.4 mmol/L時(shí)使酶達(dá)到飽和. 增強(qiáng)劑SapphireII濃度對(duì)RLU的變化較復(fù)雜，在0.5~1 g/L時(shí)達(dá)到最大RLU，以后隨著增強(qiáng)劑濃度的增加RLU反而下降. 確定底物工作液配制的濃度為：0.4 mmol/L的CSPD，增強(qiáng)劑SapphireII濃度為1.0 g/L. 2.2包被抗體濃度和酶標(biāo)記抗體濃度的確定根據(jù)不同包被抗體濃度測(cè)定定量標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值，分別做出不同濃度包被抗體RLU的曲線（圖2）. 包被濃度低時(shí)試劑的整體發(fā)光值也低，隨著包被濃度的升高發(fā)光值也相應(yīng)升高，在5.0 μg/mL時(shí)，發(fā)光值達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期（此時(shí)靈敏度達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期），選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線接近于直線時(shí)的包被濃度（5 μg/mL）為最佳. 2.3最低檢出量平行測(cè)定20孔零值校準(zhǔn)品血清，計(jì)算零值校準(zhǔn)品RLU平均值（x）及標(biāo)準(zhǔn)差(S)，以x+2 S為測(cè)定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出其對(duì)應(yīng)的濃度值，所對(duì)應(yīng)的濃度值即為最低檢出量為2.0 ng/mL. 2.4特異性檢測(cè)分別測(cè)定與CEA(3 μg /mL)、鐵蛋白(10 μg /mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙種球蛋白(200 g/L)的交叉反應(yīng)率，分別為≤0.15%， ≤0.04%， ≤2.5×10-8， ≤1.03×10-8.

［2］尹東光，賀佑豐，劉一兵，等. 幾種主要化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光性能及其化學(xué)發(fā)光免疫分析體系［J］.標(biāo)記免疫分析與臨床，2002，9(4):225-229.

［3］賀艷峰，張家明，郭小英，等. 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物［J］.化學(xué)通報(bào)，2005，68:135-146.

［4］Lin J， Yan F， Ju H. Noncompetitive enzyme immunoassay for alphafetoprotein using flow injection chemiluminescence［J］. Appl Biochem Biotechnol， 2004，117(2):93-102.

［5］Josefina MB， Neus GR. Evaluation of Ciba Corning ACS: 180TM Automated Immunoassay System［J］.Clin Chem，1994，40(3):407-410.

［6］Lin J， Yan F， Hu X， et al. Chemiluminescent immunosensor for CA199 based on antigen immobilization on a crosslinked chitosan membrane［J］.Immunol Method， 2004，291(12):165-174.

［7］Dan Chen， Lawrence A. Kaplan. Performance of a newgeneration chemiluminescent assay for Hepatitis B surface antigen［J］. Clin Chem，2006， 52:1592-1598.