作者：楊侃，景麗，安欣，秦憬，郭風英，張建中

【摘要】 目的 觀察抗體質量和封閉方法對腎小管免疫組織化學非特異性反應的影響，探討其控制方法。方法 采用免疫組織化學SP法檢測腎臟血管平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle actin，SMA），對比觀察不同公司的抗體及不同封閉方法對腎小管非特異性免疫組織化學染色的影響。結果 各組采用正常山羊血清封閉，不同抗體檢測結果可見：1號抗體組，腎小管上皮細胞內可見彌漫性棕黃色顆粒狀著色，且在腎臟皮質區內遠曲小管為重；2號抗體組，染色結果與1號抗體基本相同；3號抗體組，腎臟組織中血管平滑肌細胞內均呈棕黃色著色，腎小管上皮細胞內未見著色。各組分別采用正常山羊血清、5%BSA、25%蛋清液及正常山羊血清+25%蛋清混合液封閉后的染色結果可見：1號抗體組，采用正常山羊血清+25%蛋清混合液封閉后，腎小管上皮細胞染色強度減輕；2號抗體組，在使用不同封閉液的各組間，未見差別；3號抗體組，腎小管上皮細胞內未見著色，其中，25%蛋清+正常山羊血清混合封閉的效果最佳。結論 在免疫組織化學技術中，選擇適當的封閉液和抗體是有效控制非特異性染色的重要因素。

【關鍵詞】 免疫組織化學；腎小管；非特異性；平滑肌肌動蛋白

Abstract: Objective To explore the method to suppress the nonspecific immunoreaction of renal tubules. Methods A comparative investigation was carried among the antibodies from different companies and different blocking in the rat kidney by means of Streptavidin-peroxidase technique. Results The results using normal goat serum blocking showed that there were diffuse yellow granullar staining in renal tubule epithelium， and more powerful staining were found in distal convoluted tubule of kidney cortical in No.1 antibody group than that in other groups. The staining profile in the No.2 antibody group was the same as No.1 group. There were yellow staining in vascular smooth muscle cell of kidney， and no staining in renal tubule epithelium in the No.3 antibody group. The results using different blocking including normal goat serum，5% BSA，25% egg white， and mixing liquor of normal goat serum with 25%egg white showed that the staining intensity in renal tubule epithelium was lessen used the mixed liquid in the No.1 antibody group. There were no significant difference among the different blocking in the No.2 antibody group. There was no staining in renal tubule epithelium in the No.3 antibody group. The best immunostaining was observed in the group with mixed blocking liquid， normal goat serum with 25% egg white. Conclusion It is an important factor for immunohistochemistry to select the blocking liquid and the antibody to suppress the nonspecific reaction.

Key words: immunohistochemistry; kidney; nonspecificity; α-Smooth muscle actin

免疫組織化學技術作為研究蛋白質在細胞原位分布的一種常用方法，具有特異性強、靈敏度高等優點，能夠直接進行定性和定量的形態觀察，為疾病的診斷、鑒別診斷和發生機制等研究提供有力的手段，是一項不可缺少的技術［1］。但由于多種原因，免疫組化染色常出現非特異性染色，甚至干擾正常的染色結果。由于腎小管具有豐富的內源性過氧化物酶、生物素等成分，在免疫組織化學染色中容易出現非特異性染色，嚴重影響結果的判斷［2］。本研究采用免疫組織化學SP法染色，對比觀察不同公司的兔抗鼠血管平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle actin，SMA）單克隆抗體及四種封閉方法對腎小管非特異性免疫組織化學染色的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

取正常SD大鼠腎臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度5μm，常規HE染色，觀察腎臟組織學結構。SMA單克隆抗體為商品化產品，分別購自博海生物公司、博奧森公司、邁新公司； SP即用型羊抗兔試劑盒購自博奧森公司。其它配套試劑和常規試劑均為通用的商品化產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

按照抗體來源分為1、2、3號抗體組；按照封閉方法分為正常山羊血清、5%牛血清白蛋白（BSA）、25%蛋清、正常山羊血清+25%蛋清混合液共4組。

1.2.2 免疫組織學方法

切片脫蠟、水化；檸檬酸鹽緩沖液微波修復，自然冷卻后，PBS洗滌，3%H2O2室溫孵育10min，PBS洗滌，封閉液20min，甩去勿洗，加入SMA單克隆抗體(1∶100)室溫孵育2h，PBS洗滌，生物素化二抗室溫孵育20min，PBS洗滌，辣根酶標記的鏈酶卵白素室溫孵育30min，PBS洗滌；DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封片。以正常山羊血清封閉作為常規封閉方法，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判斷

在顯微鏡下觀察切片染色情況，陽性結果為淡黃色到棕褐色，定位于平滑肌細胞質，以血管平滑肌細胞陽性、腎小管陰性作為染色成功的標準；平滑肌細胞不著色為染色失敗的標準；具有腎小管染色者為非特異染色的標準。根據染色結果，對不同公司來源的抗體和不同封閉方法的染色結果進行評價。

2 結果

2.1 腎臟組織學觀察

腎臟結構清晰，腎小球分布正常，主要集中在腎臟皮質，腎小球大小均勻，毛細血管結構清楚，無系膜細胞和內皮細胞的增生。近曲小管、遠曲小管和集合小管分布正常，上皮細胞結構清晰，無細胞變性和壞死，腎小管腔無蛋白管型以及蛋白性物質。腎臟間質和腎盂正常，無明顯充血和水腫及炎癥反應。入球動脈和出球動脈清晰可見，具有1-2層平滑肌細胞，可見內皮細胞，無血管壁的玻璃樣變性。小葉間動脈、弓狀動脈和葉間動脈分布正常，管壁平滑肌細胞清晰可見，未見血管壁增厚以及血管炎癥反應。

2.2 不同來源抗體染色結果

均采用正常山羊血清封閉，免疫組織化學染色結果可見，1號抗體組，腎臟組織血管平滑肌細胞內可見黃色細顆粒狀著色，同時，在腎小管上皮細胞內可見彌漫性棕黃色顆粒狀著色，且在腎臟皮質區內遠曲小管為重（圖1A，見封3）；2號抗體組，腎臟組織血管平滑肌細胞內均可見呈彌漫分布的棕黃色著色，在腎小管上皮細胞內也可見彌漫性棕黃色顆粒狀著色，并以遠曲小管上皮細胞為重（圖1B，見封3）；3號抗體組，腎臟組織中血管平滑肌細胞內均呈棕黃色著色，使各級血管輪廓清晰可見，腎小管上皮細胞內未見著色，背景基本干凈（圖1C，見封3）。

2.3 不同封閉方法染色結果

分別采用正常山羊血清、5%BSA、25%蛋清液及正常山羊血清+25%蛋清混合液封閉后的免疫組織化學染色結果可見，1號抗體組在5%BSA、25%蛋清液封閉后，腎臟血管平滑肌細胞內可見局灶性細顆粒狀黃色著色，著色均比較淺淡，使血管輪廓不清晰，而在腎小管上皮細胞內可見彌漫性棕黃色顆粒狀著色，尤其是遠曲小管著色最重。采用正常山羊血清+25%蛋清混合液封閉后，腎小管上皮細胞染色強度減輕，表現為淺黃色細顆粒狀著色（圖2A，見封3）；2號抗體組，腎臟組織血管平滑肌細胞內均可見呈彌漫分布的顆粒狀棕黃色著色，同時在腎小管上皮細胞內可見彌漫性棕黃色顆粒狀著色，在使用不同封閉液的各組間無明顯差異（圖2B，見封3）。3號抗體組，腎臟組織中血管平滑肌細胞內均呈棕黃色著色，各級血管輪廓清晰可見，腎小管上皮細胞內未見著色，背景干凈，其中，25%蛋清+山羊血清混合封閉的效果最佳（圖2C，見封3）。

3 討論

免疫組織化學是在蛋白質水平上定位觀察的一種常用技術，應用范圍非常廣泛［1－2］。但是，免疫組化又是多步驟、多因素決定其結果的方法，存在很多干擾因素，甚至會導致結果的誤判和誤診。影響免疫組化結果的諸多內外因素中，富含內源性過氧化物酶、內源性生物素的組織，以及一抗的質量問題是引起非特異染色、影響免疫組化結果的常見原因。

在代謝旺盛的含有豐富線粒體細胞的組織中，如腎臟、肝臟、甲狀腺等，其所含的內源性生物素蛋白結合物廣泛存在于細胞質中，著色后出現足以以假亂真的陽性結果，引起誤判，有時會嚴重影響結果的正確判斷。本研究結果也發現腎小管的非特異染色，通過采用25%蛋清+正常山羊血清混合封閉能夠明顯減少腎小管非特異性免疫組織化學染色，這與以往的研究報道基本一致［1］。

在本實驗中我們發現，除上述因素外，在免疫組化技術中，抗體的敏感性、特異性及檢測系統的選擇和應用也是控制非特異性染色的重要因素，與有關研究一致［3］。抗體的特異性是指一種抗體只能結合某一種組織上刺激該抗體產生的特定抗原表位而引起免疫反應。事實上，任何組織的免疫表型都非常復雜，因此組織中相似的抗原表位，即共同表位與抗體的交叉反應也是混淆免疫組化結果的重要原因，所以在抗原抗體反應中，抗體的特異性就顯得特別的重要。此外，在選擇適宜的抗體時，也應考慮到其敏感性。一般而言，單克隆抗體的特異性較多克隆抗體高，但多克隆抗體的敏感性比單克隆抗體高，所以，要想得到滿意的染色結果，應該綜合考慮到抗體的特性。本實驗可以看到，使用3號抗體的各組中，選擇不同的封閉液進行封閉，血管平滑肌細胞均出現特異性染色，而腎小管上皮細胞未見非特異性著色。而在使用1和2號抗體的各實驗組中，盡管使用了各種不同的封閉方法對其非特異性進行控制，但是效果不佳，腎小管上皮細胞均仍然出現非特異染色。提示選擇優質抗體也是有效防止腎小管免疫組化非特異染色，保證免疫組化質量的重要因素。