作者：李紅冰，陳躍龍，石海峰，唐玲，馮寶民，王永奇

【摘要】 目的建立準確簡便測量油茶種子中抗腫瘤有效部位群化學成分含量的分析方法。方法采用分光光度法。結果油茶種子60%丙酮-水提物中總皂苷純度為64.90%，總黃酮含量為11.81%，總酚含量為7.40%(其中鞣質占2.43%)。結論分光光度法測定以上3種物質簡便易行，準確可靠，重復性和回收率都較理想。

【關鍵詞】 油茶種子； 抗腫瘤； 總皂苷； 黃酮； 多元酚； 鞣質

Abstract：ObjectiveTo establish the accurate and convenient method for determining the contents of total saponin，total flavonoids， total polyphenol and tannin in Camellia oleifera Abel.MethodsThe contents were determined by spectrophotometry. ResultsThe contents of total saponin， total flavonoids， total polyphend and tannin were respectively 64.90%，11.81%， 7.40% and 2.43%. ConclusionThe method is convenient and reliable for the determination of the three substances，and its reproducibility and recovery rate are fairly well.

Key words：Camellia oleifera Abel.; Anti-tumor; Saponins; Flavonoids; Polyphenols; Tannin

油茶Camellia oleifera Abel屬于山茶屬山茶亞屬油茶組植物。中國有油茶面積3 660 000 ha，年產油茶種子645 000 t［1］，資源非常豐富。但長期以來，對油茶藥用價值方面的研究，國內外鮮有報道。我們課題組在對油茶藥用價值進行研究的過程中，采用MTT比色法對其種子和油粕的石油醚、乙醇、水、60%丙酮-水的梯度溶媒提取物進行體外抗癌實驗，結果表明油茶種子60%丙酮-水提取物對人肺癌細胞株（A549）、人胃癌細胞株(SGC－7901)和人黑色素細胞瘤（A375）具有非常強的抑制作用。定性分析結果表明其含有大量皂苷、黃酮及多元酚類成分。為進一步明確其抗腫瘤的有效部位及有效成分，本文對該有效部位群中的三大類成分進行了定量分析，為抗腫瘤有效部位的分離純化提供科學依據。

1 儀器與材料

unico7200可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；Laborata4000型旋轉蒸發儀（Heidolph公司）；BP210S十萬分之一電子天平（Sartorius公司）；Jascov-560紫外可見分光光度計；油茶總皂苷對照品（湖南今漢生有限公司）；蘆丁對照品（東京化成工業株式會社）；沒食子酸（中國藥品生物制品檢定所）；所用試劑均為分析純；水為蒸餾水；油茶種子（2006-03 采集于廣西壯族自治區燕洞鄉）。

2方法與結果

2.1 總皂苷的測定［2］

2.1.1 標準品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的油茶總皂苷對照品50 mg，置100 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.5 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的樣品20 mg，甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，制得濃度為2.0 mg/ml的樣品溶液，備用。

2.1.3 測定波長的選擇取0.8 ml的對照品溶液及樣品溶液，分置于具塞試管中，揮去甲醇，精密加入新鮮配制的5%香草醛溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml加塞，于60℃水浴中反應15 min，取出，冰水中冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5.0 ml，搖勻立即在紫外分光光度計450～700 nm波長下掃描，同時空白溶液做參比，確定檢測波長為588 nm。

2.1.4 標準曲線的繪制精密吸取對照品溶液 0.0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 ml，分置于具塞試管中，揮去甲醇，精密加入新鮮配制的5%香草醛溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml加塞，于60℃水浴中反應15 min，取出，冰水中冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5.0 ml，搖勻， 隨行做空白實驗，588 nm波長下測吸光度。計算得回歸方程為：Y=0.467X-0.008 2(r=0.999 9)。線性范圍為0.2～1.0 mg/ml。

2.1.5 樣品測定精密吸取供試品溶液0.5 ml，置于具塞試管中，揮去甲醇，照標準曲線項下的方法操作，測定吸收值，從標準曲線中讀出供試品溶液中總皂苷的量，計算，即得。

2.1.6 重復性實驗精密吸取供試品溶液0.5 ml置于具塞試管中，揮去甲醇，照標準曲線項下的方法操作，測定吸收值，平行測定5次，代入回歸方程，計算總皂苷的含量。結果見表1。表1 總皂苷測定的重復性實驗結果（略）

2.1.7 加樣回收率實驗精密吸取已知總皂苷含量的供試品溶液0.2 ml置于具塞試管中，分別加入0.5 mg/ml的油茶總皂苷標準溶液0.5 ml，揮去甲醇，按標準曲線繪制項下的方法操作，平行測定5次，計算加樣回收率。結果見表2。表2 總皂苷測定的加樣回收率實驗結果（略）

2.2 黃酮的含量測定［3］

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品20 mg，置100 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.2 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備精確量取油茶60%丙酮-水提取物0.250 7 g置100 ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 ml置100 ml容量瓶中加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.501 4 mg/ml的供試品溶液。

2.2.3 測定波長的選擇蘆丁對照品溶液和供試品溶液NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后，用分光光度計在200～600 nm區間進行掃描。均在500 nm處有最大吸收，因此選擇500 nm為測定波長。測得的結果以蘆丁為基準計算總黃酮的含量。

2.2.4 標準曲線的繪制精密吸取蘆丁對照品溶液0.0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 ml分別置于試管中，各加甲醇至2.5 ml，再分別加入質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液0.25 ml，搖勻，室溫放置5min后，再加10%硝酸鋁溶液0.25 ml，搖勻，室溫放置5 min后，加入4%的氫氧化鈉溶液2.0 ml，搖勻，室溫放置15 min。以相同試劑為空白在500 nm處測吸光度（A），以A值為縱坐標，濃度C(mg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=0.5448C+0.007 8(r=0.999 9)，線性范圍為0.034 2～0.163 mg/ml。

2.2.5 樣品測定精密吸取供試品溶液1.5 ml置于試管中，加入甲醇至2 ml，照標準曲線項下的方法操作，測定吸收值，從標準曲線中讀出供試品溶液中蘆丁的量，計算，即得。

2.2.6 重復性實驗精密吸取供試品溶液1.5 ml置于試管中，加入甲醇至2 ml，照標準曲線項下的方法操作，測定吸收值，平行測定5次，代入回歸方程，計算總黃酮的含量。結果見表3。表3 總黃酮測定的重復性實驗結果（略）

2.2.7 加樣回收率實驗精密吸取已知總黃酮含量的供試品溶液1.5 ml置于試管中，分別加入蘆丁對照品溶液0.5 ml，余下部分按照標準曲線項下的方法操作，平行測定5次，計算加樣回收率。結果見表4。表4 加樣回收率實驗結果（略）

2.3 多元酚及鞣質的含量測定［4］

2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品10 mg，置100 ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 ml，置100 ml棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.025 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備精密量取油茶種子60%g丙酮-水提取物干浸膏0.508 0 g置于200 ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液20 ml。精密吸取續濾液5 ml置50 ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液Ⅰ(0.254 mg/ml)。精密吸取續濾液5 ml置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，倒入已盛有600 mg干酪素的具塞錐形瓶中，30℃水浴加熱1 h，時時振搖，取出，放冷，過濾，棄去初濾液10 ml，續濾液作為供試品溶液Ⅱ（0.254 mg/ml），備用。

2.3.3 測定波長的選擇沒食子酸對照品溶液和供試品溶液經磷鉬鎢酸-碳酸鈉顯色后，用紫外可見分光光度計在400～1 000 nm區間進行掃描。結果表明最大吸收波長為754 nm，因此選擇754 nm做為測定波長。測得的結果以沒食子酸為基準計算總酚和鞣質的含量。

2.3.4 標準曲線的繪制精密吸取沒食子酸標準溶液0.0，0.5，1.0，1.5， 2.0，2.5 ml分別置于10 ml棕色量瓶中，各加水至5ml再分別加入1ml磷鉬鎢酸試液，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。搖勻，以相同試劑為空白，30 min后在754 nm處測定吸光度（A），以A值為縱坐標，濃度C(mg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：A=0.3155C+0.007 9，r=0.999 8。線性范圍為0.010 7～0.053 2 mg/ml。

2.3.5 總酚的測定精密吸取供試品溶液Ⅰ1.0 ml置于10 ml棕色容量瓶中，照標準曲線項下的方法，自“加入1 ml磷鉬鎢酸試液”起，同法測定吸收值，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量，計算，即得。

2.3.6 不被吸附的多元酚測定精密吸取供試品溶液Ⅱ 2.0 ml置于10 ml棕色容量瓶中，照標準曲線項下的方法，自“加入1 ml磷鉬鎢酸試液”起，同法測定吸收值，從標準曲線中讀出供試品溶液中不被吸附的多酚的量，計算，即得。 鞣質含量=總酚量-不被吸附的多酚量

2.3.7 重復性實驗精密吸取供試品溶液Ⅰ 1.0 ml置于10 ml的棕色容量瓶中，照標準曲線繪制項下的方法操作，測定吸收值，平行測定5次，代入回歸方程，計算總酚的含量，結果見表5；精密吸取供試品溶液Ⅱ 2 ml置于10 ml的棕色容量瓶中，照標準曲線項下的方法操作，測定吸收值，平行測定5次，代入回歸方程，計算不被吸附的多酚的含量。結果見表6。表5 總酚測定的重復性實驗結果（略）表6 不被吸附多酚的重復性實驗結果（略）

2.3.8 加樣回收率實驗精確吸取已知總酚含量的供試品溶液Ⅰ1 ml和 已知不被吸附的多酚含量的供試品溶液Ⅱ2 ml置于10 ml棕色容量瓶中，分別加入0.025 mg/ml的沒食子酸標準溶液0.5 ml，余下部分照標準曲線繪制項下的方法操作，平行測定5次，計算加樣回收率。結果見表7～8。表7 總酚測定的加樣回收率實驗結果（略）表8 不被吸附多酚的加樣回收率實驗結果（略）

3討論

皂苷的分析測定有多種方法，但分光光度法操作簡便、靈敏，屬于經典、成熟的方法。采用分光光度計法測定其總皂苷的含量，其結果為64.90%。 以蘆丁為對照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系為顯色劑，利用分光光度法測定總黃酮含量，操作簡便，靈敏度高，重復性好，結果可靠。研究結果表明油茶種子60%丙酮-水提物種總黃酮含量為11.81%。 總酚與鞣質含量測定方法主要是參考了《中國藥典》鞣質測定方法，以沒食子酸為對照品穩定性好，干酪素吸附作用具有專屬性，操作簡便，且重復性和回收率都較理想。測定結果：總酚含量為7.40%，其中鞣質為2.43%。 對于在這一有效部位群中，具體是哪一類成分為抗腫瘤的有效成分及其作用的機理，本研究組正在進一步研究中。