作者：王冠軍，孫明學，盧世璧*，許文靜，趙斌，彭江，張莉，黃靖香

【摘要】 目的］改進去細胞異體神經化學萃取制備方法，制備出細胞及髓鞘去除完全、神經機構保存完好的去細胞異體神經移植物。［方法］SD大鼠14只，取雙側坐骨神經（共28根），分3組進行化學萃取去細胞處理：Sondell法組（10根）、改良法組（10根）和 對照組（8根）。Sondell法組所用萃取劑為Triton X-100和脫氧膽酸鈉；改良法組所用萃取劑為Triton X-200、SB-10和SB-16；對照組未進行化學處理。處理后神經行HE染色、快藍染色、基底膜素免疫組化染色及環境掃描電鏡觀察，并從去細胞程度、髓鞘染色分級和結構完整性三方面綜合評價。［結果］在去細胞異體神經物理性狀方面，改良法制備的去細胞異體神經韌性彈性略好于Sondell法；HE染色表明，2種方法的去細胞效果均較好，但改良法對神經結構的破壞較小；快藍染色、基底膜素免疫組化染色、環境掃描電鏡結果均表明，改良法在對髓鞘的去除、基底膜素的保留及神經結構的保存方面均優于Sondell法；綜合質量評分結果表明，2種方法在去細胞效果方面相似（P1＞0.05），髓鞘去除及神經結構的保存方面改良法優于Sondell法（P2、P3＜0.05），綜合去細胞程度、髓鞘染色分級和結構完整性３方面，改良法制備的去細胞異體神經質量優于Sondell法（P4＜0.05）。［結論］綜合運用萃取劑Triton X-200、SB-10和SB-16的化學萃取方法，是一種較為理想的去細胞異體神經制備方法，能夠制備出免疫物質清除完全、神經結構較好保存的去細胞異體神經移植物，為自體神經移植找到了較好的替代解決方法。

【關鍵詞】 周圍神經； 化學萃取； 去細胞異體神經

自體神經移植是目前 臨床上修復周圍神經缺損的“金標準”，但有諸多缺點：增加手術創傷，造成供區功能障礙；且因供體有限，常無法滿足較大神經缺損或較廣泛神經損傷修復的需要。異體神經是人們一直想利用的自體神經移植替代材料，但是新鮮異體神經移植會導致移植失敗的免疫排斥反應。采用化學萃取方法能較好地降低異體神經的免疫反應，但處理不同，有時對神經的結構破壞太大。目前已認可的化學制備方法有Sondell法，即運用萃取劑Triton X-100和脫氧膽酸鈉。但此法仍有許多待改進之處［1］，神經基底膜管及細胞外基質結構仍存在不同程度的破壞，影響神經的再生。本研究旨在進一步改良去細胞異體神經的制備方法，在清除神經免疫原性物質的同時，較好地保存了其三維網管狀結構，以期研制出一種更為理想的去細胞異體神經移植物。 1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康成年SD大鼠14只(解放軍總醫院動物中心提供)，體重270～300 g/只。

1.2 實驗儀器、試劑 回旋式恒溫振蕩器(上海)，環境掃描電鏡（QUANTA 400，清華大學提供），Triton X 100，脫氧膽酸鈉，Triton X 200 ，sulfobetaine-10 (SB-10)， sulfobetaine-16 (SB-16)，上述試劑均購自美國Sigma公司。

1.3 去細胞異體神經的分組及制備 取14只大鼠，用10%水合氯醛0.4 ml/100 g麻醉后，切取雙側坐骨神經，每根神經長約20 mm，共28根神經。仔細剔除神經外脂肪、血管及結締組織。分3組進行處理：Sondell法組（10根）、改良法組（10根）和 對照組（8根）。Sondell法組所用萃取劑為：Triton X-100和脫氧膽酸鈉，步驟為：（1）蒸餾水中振蕩浸浴12h；（2）3%Triton X-100溶液中振蕩萃取12h；（3）4%脫氧膽酸鈉溶液中振蕩萃取24h；（4）重復上述步驟1次；（5）蒸餾水沖洗30 min。改良法組所用萃取劑為：Triton X-200、SB-10和SB-16，步驟為：（1）蒸餾水中振蕩浸浴12 h；（2）125mmol/L SB-10溶液中振蕩萃取12h；（3）0.14% Triton X-200和0.6 mmol/L SB-16溶液中振蕩萃取24 h；（4）重復上述步驟1次；（5）PBS（pH=7.2，下同）沖洗30 min。2種方法處理均在25℃下進行，處理后的神經于4℃下、PBS液中儲存備用。對照組神經不作化學處理。

1.4 去細胞異體神經的組織學評價

1.4.1 光鏡觀察 3組各取神經6、6、4根，于各神經同位置處切取神經（橫向切片取5 mm長神經，縱向切片取10 mm長神經），常規石蠟包埋，厚為5μm的橫向和縱向組織學切片；HE染色，觀察去細胞程度和圍繞神經軸突的基底膜管結構的完整性；快藍染色，觀察髓鞘殘留成分；基底膜素免疫組化染色，觀察基底膜素的保留。

1.4.2 掃描電鏡觀察 3組各取神經4根，于2%OsO4（2%鋨酸）溶液中固定24 h后，二甲胂酸鈉緩沖液沖洗，濾紙蘸干水分，投入液氮中冷凍，取出后迅速切成5 mm小段，于冷凍干燥機中干燥固定后，環境掃描電鏡下觀察基底膜管結構的完整性及去髓鞘程度。

1.4.3 去細胞異體神經質量評價 按下述評分標準［2］：（1）去細胞程度：去細胞完全評為0分，殘余細胞占總數的百分率≤25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別評為1、2、3、4分；(2)髓鞘染色分級：（－）、（±）、（＋）、（＋＋）分別評為0、1、2、3分；(3)基底膜管完整性：結構完整無破壞評為0分，結構破壞占總面積的1%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別評為1、2、3、4分。正常神經各組織學染色作為對照。由病理專業人員按去細胞程度、髓鞘染色分級和結構完整性觀察的標準，行雙盲觀察計分，綜合評分，分數越低，表示制備的質量越好。

1．5 統計學分析 用SPSS 11.5統計分析軟件進行數據處理，組間對比用成對資料的t檢驗，P<0.05時，有顯著性差異。 2 結果

2.1 物理性狀 Sondell法與改良法制備的去細胞異體神經，在外觀上無明顯差別，均呈淡乳白色、略透明外觀，其直徑和長度均略小于化學萃取前的新鮮神經。牽拉2種方法制備去細胞異體神經，其延展性均較化學萃取前略增加。顯微鏡下行神經外膜縫合操作，感其韌彈性略差于新鮮神經，但均可在無張力下行常規的神經吻合，改良法制備的去細胞異體神經韌彈性略好于Sondell法，但無統計學意義。

2.2 常規組織學觀察

2.2.1 HE染色 正常神經可觀察到軸突、雪旺細胞及細胞外基質等結構。Sondell法組與改良法組中縱切片上均見不到任何細胞，紅染的神經內膜呈波浪狀縱形排列，軸突、髓鞘結構消失而形成管柱狀空隙；橫切片上軸突及細胞均消失，代之以紅染的神經內膜形成的不規則圓形空腔，周邊可見到紅染的神經束膜及外膜。Sondell法組在縱切片中于紅染的神經內膜之間出現了大的空隙；在橫切片中于紅染的經內膜圓形空腔間出現了大的空隙，而改良法組在縱、橫切片，神經內膜管的排列均勻一致，均未出現大的空隙（圖1a、1b）。

2.2.2 快藍染色 正常神經可觀察到藍色的髓鞘和藍黑色的細胞核結構。Sondell法組與改良法組中均顯示細胞完全消失、髓鞘大部分消失。 Sondell法組殘留的髓鞘染色較重，改良法組較輕（圖2a、2b）。

2.2.3 基底膜素免疫組化染色 正常神經縱切片上，染成金黃色的基底膜素呈帶狀縱形排列；橫切片上，黃染的基底膜素繞在軸突的外周，形成不規則圓形空腔。Sondell法組與改良法組中均可見到大部分黃染的基底膜素的保留。 Sondell法組中基底膜素染色較輕，改良法組較重。

2.3 環境掃描電鏡觀察 正常神經可由髓鞘和基底膜環繞形成的圓形小空腔，空腔管壁完整無破壞。Sondell法與改良法制備的去細胞異體神經均可見到基底膜保留，管腔擴大。Sondell法制備的去細胞異體神經可見到較多的空腔管壁不完整，相互融合連成大的空腔。改良法中小空腔排列規范，管壁破壞的較少，較少見到融合的大空腔（圖3a、3b）。

2.4 質量評價 病理切片的去細胞程度、髓鞘染色分級和結構完整性，評分見表1。Sondell法組與改良法組在去細胞程度、髓鞘染色分級、結構完整性以及綜合質量評分(綜合去細胞程度、髓鞘染色分級和結構完整性)的統計量分別用t1、t2 、t3、 t4及P1、 P2、 P3、P4表示，統計學分析見表2。

表1 化學去細胞異體神經質量各標本評分（略）

表2 化學去細胞異體神經質量評分統計（略）

*無統計學意義；**有統計學意義 3 討論 去細胞異體神經移植物是自體神經移植較好的替代物。影響去細胞異體神經移植物質量的主要因素有免疫原性物質的去除程度和神經三維網管狀結構的完整性。 在同種異體移植中，與免疫排斥反應有關的是組織中存在的主要組織相容性抗原（MHC），其中MHCⅠ類抗原的影響程度較MHCⅡ類抗原弱。在周圍神經的結構組成中，同種異體移植的抗原性主要存在于雪旺氏細胞和髓鞘，而由膠原組成的神經內膜、神經束膜和神經外膜的抗原性則非常弱。其中，移植物中的雪旺氏細胞與免疫排斥反應有著十分重要的關系，同種異體神經移植時在雪旺氏細胞上表達很強的MHCⅠ類和Ⅱ類抗原［3］。

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