作者：趙寧張英起王增祿劉昌孝陳拯民顧以保蔡永明高連用李全勝曾勇

【關鍵詞】 腫瘤壞死因子α 關鍵詞: 腫瘤壞死因子α;藥代動力學;放射測量術;HPLC;ELISA 摘 要:目的 為探討新型重組人腫瘤壞死因子（nrTNFα）藥代動力學而建立生物樣品中nrhTNFα的檢測方法. 方法 ①方法Ⅰ（RA）:動物肌注125 Ⅰ標記的nrhTNFα后，測定各生物樣品中的總放射活性;②方法Ⅱ（HPLC-RA）:上述生物樣品先經(jīng)HPLC分離后，收集并測定其中125 Ⅰ-nrhTNFα部分的放射活性;③方法ⅢEILISA法. 結(jié)果 RA，HPLC-RA法檢測的nrhTNFα質(zhì)量濃度與放射性呈直線相關（RA，r=0.999HPLC-RA，r=0.999）.ELISA法證明rhTNFα的酶聯(lián)免疫檢測藥盒適用于nrhTNFα的檢測，rhTNFα的標準曲線與nrhTNFα的標準曲線顯正相關，r=0.994.這一檢測系統(tǒng)與其他細胞因子包括IFNα，TNFβ，IL-2和IL-6無交叉反應. 結(jié)論 RA，HPLC-RA和ELISA法均可作為nrhTNFα的藥代動力學實驗方法.

Keywords:tumor necrosis factor-alpha;pharrmacokinetics;radiometry;HPLC;ELISA Abstract:AIM To establish three methods of detecting nrh-TNFαin biological samples for investigating the pharma-cokinetics of nrhTNFα.METHODS Method I（RA）:Mea-suring the total radioactivity in biological samples after125 Ⅰ-nrhTNFαadministration by im injection to animals.MethodⅡ（HPLC-RA）:Collecting and measuring the radio activity of125 Ⅰ-nrhTNFαafter samples separated by HPLC.MethodⅢ:ELISA.RESULTS The mass concentrations of nrhTNFαmeasured by RA and HPLC-RA had straight line correlation with their radioactivity.It was demonstrated that the rhTNFαELISA kit was suitable for nrhTNFαdetection and both standard curves of rhTNFαand nrhTNFαhad a good positive correlation with a correlation coefficient of0.994.The ELISA system showed no cross reaction with any other cytokines including IFNα，TNFβ，IL-2and IL-6.CON┐CLUSION Three methods（RA，HPLC-RA，and ELISA）established for detecting nrhTNFαin biological sampis could be used as pharmacokinetic methods of nthTNFα. 0 引言 腫瘤壞死因子（TNF）是當代的研究熱點［1-10］ .實驗方法對藥代動力學研究是至關重要的.測定方法的特異性、靈敏度和準確性是研究的基礎，對于基因工程表達的多肽類藥物更是如此，因為它不但受體內(nèi)大量物質(zhì)的干擾，而且由于藥物劑量很?。é蘥），體內(nèi)濃度又極低，這就加大了測定的難度.為了對新型腫瘤壞死因子進行藥代動力學研究，我們參考文獻方法［11-14］建立了相應的藥代動力學實驗方法. 1 材料和方法 1.1 材料 新型重組人腫瘤壞死因子（簡稱nrhT-NF）由第四軍醫(yī)大學生物技術中心提供，純度經(jīng)GFC-HPLC分析鑒定純度為97.5%;昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22g，由天津藥物研究院動物室提供;儀器HPLC及Biosep SEC-S3000柱為美國Phenmenex公司產(chǎn)品;γ-計數(shù)器FT-630型為北京核儀器廠出品;450型酶標儀為美國Bio Rad公司產(chǎn)品;ELISA試劑盒由第四軍醫(yī)大學免疫學教研室提供. 1.2 方法 1.2.1 放射活性測定（RA）法 標準曲線的制備以1000μg?L-1 nrhTNFα標準液（0.05mol?L-1 磷酸緩沖液，7.40×108 Bq?L-1 的125 I-nrhTNF）配成質(zhì)量濃度為0.02，0.1，0.5，4，20和100μg?L-1 的應用液，各取20μL置于測定管中，γ-計數(shù)器測定，將質(zhì)量濃度與計數(shù)值（cpm）繪成標準曲線.按照標準曲線方法分別做血清、腦、脂肪、心、肌肉、肝、脾組織中125 I-nrhTNFα的校正曲線. 1.2.2 HPLC分離結(jié)合放射活性測定（HPLC-RA）法 標準曲線按RA法中標準曲線制備方法配制成應用液，各取10μL經(jīng)SEC S3000柱在HPLC上分離，收集固定時間的洗脫液，置于測定管中，在γ-計數(shù)器上計數(shù)，將濃度與計數(shù)值（cpm）繪制成標準曲線.以同樣方法制備血清中nrhTNFα的校正曲線，并測定質(zhì)量濃度為0.5，4.0，20.0μg?L-1 時血清樣品經(jīng)HPLC分離后nrhTNFα的量，以計算回收率. 1.2.3 酶聯(lián)免疫測定（ELISA）法 采用第四軍醫(yī)大學免疫學教研室rhTNFα試劑盒，以一株mAb包被96孔板，4℃過夜，樣品和標準品均做復孔，每孔加樣100μL.另一株mAb作酶標抗體，加TMB于37℃反應15min后以2mol?L-1 硫酸終止反應，在酶標儀上測定各孔的吸收度，檢測波長為450nm，給藥小鼠或正常對照小鼠眼眶取血，室溫放置30min后于4000r?min-1 離心15min，分離出血清，立即加入甲基氟磺酸至1mmol?L-1 ，-20℃保存，當天樣品24h內(nèi)測定完畢.以0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600μg?L-1 nrhTNFα做血清中nrhTNFα的標準曲線. 2 結(jié)果 采用Iodoge法進行標記的125 I-nrhTNFα經(jīng)sephacryl S-200HR柱純化后放射活性濃度為14.80×108 Bq?L-1 ，放射比活性為15.90×108 Bq?L-1 ，放射化學純度在95%以上. 2.1 RA法 標準曲線和校正曲線表明，nrhTNFα質(zhì)量濃度與cpm呈直線相關，標準曲線方程為Y=8.4+533X（r=0.999），血清、腦、脂肪、心、肌肉、肝和脾組織的校正曲線方程分別為:Y=7.5+513X（r=0.999，血清）、Y=8.2+688X（r=0.994，腦）、Y=5.0+653X（r=0.999，脂肪）、Y=12.3+618X （r=0.999，脾）、Y=14.5+651X（r=0.996，肌肉）、Y=0.5+671X（r=0.995，肝）、Y=12.3+618X（r=0.999，心）.從血清中直接測定nrhTNF的回收率（Tab1），其批內(nèi)和批間測定精密度良好（Tab2），變異系數(shù)（CV%）符合實驗要求，檢測靈敏度為0.01μg?L-1 .