【摘要】 目的 建立健康家兔服用大川芎丸后血清中阿魏酸（FA）的高效液相色譜測(cè)定法（HPLC），并研究阿魏酸在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。方法 用HPLC法，色譜柱為Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm），流動(dòng)相為：甲醇∶水∶冰乙酸（49∶50.745∶0.255，V/V），流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm。FA用內(nèi)標(biāo)（香豆精）法定量。結(jié)果 FA的最低檢測(cè)限為0.25 ng，最低血清檢測(cè)濃度為5 ng· mL-1（S/N>3），線性范圍是26.4～4224 ng·mL-1，r =0.9999.平均加樣回收率為98.17％±1.26％.結(jié)論 該方法靈敏、快速、簡(jiǎn)便、專一性和重現(xiàn)性好，可用于阿魏酸血藥濃度分析及藥代動(dòng)力學(xué)研究。

【關(guān)鍵詞】 大川芎丸 阿魏酸 血清 家兔 HPLC

Pharmacokinetics of Ferulic Acid in Rabbit after Administering DACHUANXIONGWAN

Abstract：objective To establish the method for determining ferulic acid in serum by HPLC and study the pharmacokinetics in healthy rabbit after taken DCXW.Methods Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）was used as the stationary phase，methanol-Water-acetic acid（49∶50.745∶0.255，V/V）was used as mobile phase，flow rate of mobile phase was 1.0 mL·min-1，wavelength of detection was 322 nm.The Coumarin was used as inner standard.Results The detection limit of FA was 0.25 ng，and the lowest detectable concentration of FA was 5 ng·mL-1，with a linearity of 26.4-4224 ng·mL-1，r=0.9999.The mean recovery rate of FA was 98.17％±1.26％.Conclusion This method is sensitive，fast，simple，specific and reproducible.It can be used to the analysis of FA in serum and the study of pharmacokinetics.

Key words:DACHUANXIONGWAN；ferulic acid；serum；rabbit；HPLC

收稿日期 ２００８－０１－３０修回日期 ２００８－０２－２８

基金項(xiàng)目 國(guó)家973項(xiàng)目：方劑現(xiàn)代科學(xué)研究—方劑作用機(jī)理與物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，項(xiàng)目編號(hào)G1999054402.

作者簡(jiǎn)介 王 興(１９７３－ ）男，成都市人，教授，博士后。主要研究方向：中藥多靶點(diǎn)藥理基因表達(dá)差異譜及中藥新藥研究。E-mail:wshing@263.net大川芎丸出自金·劉完素《宣明論方》卷二，用于治療“首風(fēng)，旋暈眩急，外合陽(yáng)氣，風(fēng)寒相搏，胃膈痰飲，偏正頭痛，身拘倦。”是治療偏頭痛的傳統(tǒng)方劑。大川芎丸的現(xiàn)代研究始于國(guó)家“九五”攻關(guān)，對(duì)這樣一個(gè)傳統(tǒng)中藥復(fù)方進(jìn)行現(xiàn)代化研究，明確它的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理，已成為“973”國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目之一。該項(xiàng)目前期研究表明，阿魏酸（FA）有明顯的抗血小板釋放5-HT作用，是方中的主要有效成分［1］。為進(jìn)行大川芎丸的復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)研究，我們?cè)谖墨I(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上建立了用改良水浴法去除血清蛋白，測(cè)定家兔服用大川芎丸后血清中的阿魏酸（FA）的含量，首次成功的研究了家兔服用大川芎丸后體內(nèi)FA的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

惠普公司高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，Agilent 1100型，VWD紫外檢測(cè)器；LD4-2型低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TGL-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；電熱恒溫水浴鍋；XK96-A型快速混勻器，江蘇姜堰市新康儀器廠；GB204型萬(wàn)分之一電子天平，瑞士生產(chǎn)。王興.健康家兔服用大川芎丸后體內(nèi)阿魏酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究

成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2008年3月，3(1)

1.2 試藥與試劑

阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：0773-9910），中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；香豆精對(duì)照品（批號(hào)8806615），含量99%，mp68.9℃～70.0℃，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站；大川芎丸標(biāo)準(zhǔn)提取物１號(hào)樣（川芎∶天麻＝4∶1，0.867g膏/g生藥），由中國(guó)中醫(yī)研究院中藥所提供；醋酸、甲醇、冰乙酸均為AR級(jí)，水為雙重蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年家兔，體重2.3 kg～2.9 kg，雌雄各半；由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

定性用FA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用電子天平精密稱取4 mg FA標(biāo)準(zhǔn)品，置一10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微量移液器吸取10 μL置于1.5 mL離心管中，用甲醇稀釋至1 000 μL，搖勻，即標(biāo)準(zhǔn)液濃度為4 ng·μL-1。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用FA標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)香豆精溶液的配制：精密稱取FA 6.6 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度為母液1（132 μg·mL-1）。母液1稀釋10倍后為母液2（13.2 μg·mL-1），母液2稀釋10倍為母液3（1.32 μg·mL-1）。精密稱取香豆精5.03 mg于100 mL棕色容量瓶中，加0.3 mL甲醇助溶后用雙蒸水稀釋至刻度（50.3 μg·mL-1）為母液4.上述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液密封后置4℃冰箱待用［2］。

1.5 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇∶水∶冰乙酸（49∶50.745∶0.255，V/V）；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm；進(jìn)樣量：20 μL.

1.6 樣品預(yù)處理及測(cè)定

用微量移液器精密吸取0.5 mL空白兔血清置于一干凈的5 mL 玻璃具塞錐形離心試管中，加入30 μL蒸餾水，再加入100 μL FA（4 ng·μL-1）標(biāo)準(zhǔn)液，加入10 μL香豆精內(nèi)標(biāo)液，渦旋混勻15 s，100℃水浴10 min，用超微型攪拌器攪拌1 min制成勻漿，置低速離心機(jī)中離心20 min，3 500 r/min，吸取上清液后再加入等量甲醇，渦旋混勻15 s，用氮?dú)饬鞔蹈桑偌?00 μL甲醇復(fù)溶，置臺(tái)式高速離心機(jī)中離心5 min，10 000 r/min ，吸取上清液，取20 μL直接進(jìn)行HPLC測(cè)定［3～5］，以峰面積進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)研究

在本色譜條件下，阿魏酸、內(nèi)標(biāo)香豆精與血清中的雜質(zhì)峰均作到基線分離，與血清峰無(wú)重合，樣品峰與雜質(zhì)峰的分離度＞1.5，見(jiàn)圖1.

2.2 血清中阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及其最低血清檢測(cè)濃度的測(cè)定于8支尖底離心試管中分別加入不同的FA標(biāo)準(zhǔn)液，分別精密加入0.5 mL空白兔血清，制成含F(xiàn)A分別為0.00 ng·mL-1、26.4 ng·mL-1、52.8 ng·mL-1、105.6 ng·mL-1、211.2 ng·mL-1、1 056 ng·mL-1、2 112 ng·mL-1、4 224 ng·mL-1的血清標(biāo)準(zhǔn)液，搖勻后按樣品預(yù)處理項(xiàng)下操作測(cè)定（n=6），以FA與內(nèi)標(biāo)面積之比對(duì)應(yīng)濃度進(jìn)行回歸，線性范圍是26.4～4 224 ng·mL-1，進(jìn)樣量為20 μL.得回歸方程［6，7］：Y=1 350.635 X-87.445 7，r=0.999 9，表明在26.4～4 224 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)S/N>3時(shí)，F(xiàn)A檢測(cè)限為0.25 ng，按照樣品預(yù)處理方法處理后，測(cè)得最低血清檢測(cè)濃度為5 ng·mL-1。

2.3 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

FA 3種濃度按樣品預(yù)處理項(xiàng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下處理和測(cè)定，以加入已知量為理論值，實(shí)際測(cè)得面積比代入回歸方程中計(jì)算值為測(cè)定值，二者相比求得相對(duì)回收率和日內(nèi)精密度。取同一批樣品，不同天數(shù)測(cè)定，同法求得日間精密度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2.表1 FA在血清測(cè)定的方法回收率 表2 FA在血清測(cè)定的精密度

2.4 阿魏酸在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

大川芎丸日服劑量為35 g生藥，正常成年人體重按60 kg計(jì)算，即0.5833 g生藥·kg-1體重，家兔灌胃量為人臨床用藥量的20倍，即11.667g生藥/kg體重。健康成年家兔10只（n=10），雌雄各半，灌胃前禁食不禁水24h，取空白血清，然后按每只體重灌胃大川芎丸標(biāo)準(zhǔn)提取物5號(hào)樣后于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min各取血1 mL，分別離心得血清0.5 mL，這些樣品除不加阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)液外均同樣采用前述樣品預(yù)處理方法進(jìn)行樣品預(yù)處理［8］。進(jìn)樣20 μL.測(cè)得家兔服用大川芎丸浸膏后阿魏酸的經(jīng)時(shí)血藥濃度，結(jié)果見(jiàn)圖2.

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)3P97藥動(dòng)學(xué)軟件，在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行計(jì)算并擬合判別。綜合判斷，家兔口服大川芎丸標(biāo)準(zhǔn)提取物后體內(nèi)阿魏酸的分布及代謝屬于二室模型。其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3. 表3 家兔服用大川芎丸后阿魏酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

3.1 中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究中，多以中藥的單體成分進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，這顯然不能代表整個(gè)中藥方劑的體內(nèi)過(guò)程。中藥效應(yīng)成分動(dòng)力學(xué)是比較適合中藥藥動(dòng)學(xué)研究的方法，但目前報(bào)道的中藥復(fù)方效應(yīng)成分動(dòng)力學(xué)研究還較少。作者首次對(duì)大川芎丸進(jìn)行了中藥復(fù)方效應(yīng)成分動(dòng)力學(xué)研究，由藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可知，家兔ig大川芎丸后其效應(yīng)成分阿魏酸自胃腸道吸收非常迅速，分布較快，這為大川芎丸服用后可迅速緩解偏頭痛癥狀提供了依據(jù)。

3.2 在藥動(dòng)學(xué)方法學(xué)研究中，作者采用了改良水浴法。水浴法具有步驟簡(jiǎn)單、誤差小、無(wú)毒、費(fèi)用低廉、高效等特點(diǎn)，但是該方法對(duì)色譜柱有很大的損傷，影響色譜柱的壽命。改良水浴法在水浴法的基礎(chǔ)上采取N2吹干后甲醇復(fù)溶的方法，又可除去大量蛋白沉淀，不僅使色譜圖中血清峰的干擾減少，同時(shí)也對(duì)色譜柱起到了很好的保護(hù)作用，使色譜柱的使用壽命延長(zhǎng)。

3.3 阿魏酸是大川芎丸中主藥川芎的有效成分之一，具有明顯的抗血小板釋放5-HT作用。但是僅通過(guò)阿魏酸的藥動(dòng)學(xué)研究還不能完全反映大川芎丸的體內(nèi)過(guò)程，還需對(duì)方中的其它有效成分如川芎嗪、天麻素等進(jìn)行體內(nèi)變化規(guī)律的研究。

【參考文獻(xiàn)】 ［1］楊奎，周明眉，姜遠(yuǎn)平.川芎嗪、阿魏酸對(duì)血小板釋放5-HT的影響［J］.中藥藥理與臨床，2000，16(增刊): 18. ［2］胡瑞娟，王興，黃熙.健康家兔服用大川芎丸后血清中阿魏酸的RP-HPLC測(cè)定方法［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（2）：31-33. ［3］黃熙，任平，張莉.HPLC直接測(cè)定血清中的阿魏酸—方劑血樣預(yù)處理新方法（Ⅰ）［J］.中草藥，1999，30（3）：175-178. ［4］黃熙，陳可冀，任平.高效液相色譜直接測(cè)定沸水浴處理人血清中冠心Ⅱ號(hào)來(lái)源的阿魏酸［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1999，19（2）：71-74. ［5］常子軍，張莉，黃熙.健康人服用黃芪當(dāng)歸合劑后體內(nèi)阿魏酸的HPLC法測(cè)定［J］. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，18（2）：100-102. ［6］王驪驪，黃熙，任平.反相高效液相色譜法測(cè)定冠心Ⅱ號(hào)湯劑中芍藥甙和阿魏酸的含量［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（1）：51-52. ［7］常明向，徐蓮英，陶建生.阿魏酸納大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究［J］.西北藥學(xué)雜志， 1995，10（2）：81-83. ［8］尚剛偉，黃熙，蔣永培.正常人口服川芎?jiǎn)渭鍦珓┖篌w內(nèi)阿魏酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中藥藥理與臨床，1999，12（6）：38-40.