【摘要】 目的 建立健康家兔服用大川芎丸后血清中阿魏酸（FA）的高效液相色譜測定法（HPLC），并研究阿魏酸在大鼠體內的藥代動力學。方法 用HPLC法，色譜柱為Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm），流動相為：甲醇∶水∶冰乙酸（49∶50.745∶0.255，V/V），流速1.0 mL·min-1，檢測波長322 nm。FA用內標（香豆精）法定量。結果 FA的最低檢測限為0.25 ng，最低血清檢測濃度為5 ng· mL-1（S/N>3），線性范圍是26.4～4224 ng·mL-1，r =0.9999.平均加樣回收率為98.17％±1.26％.結論 該方法靈敏、快速、簡便、專一性和重現性好，可用于阿魏酸血藥濃度分析及藥代動力學研究。

【關鍵詞】 大川芎丸 阿魏酸 血清 家兔 HPLC

Pharmacokinetics of Ferulic Acid in Rabbit after Administering DACHUANXIONGWAN

Abstract：objective To establish the method for determining ferulic acid in serum by HPLC and study the pharmacokinetics in healthy rabbit after taken DCXW.Methods Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）was used as the stationary phase，methanol-Water-acetic acid（49∶50.745∶0.255，V/V）was used as mobile phase，flow rate of mobile phase was 1.0 mL·min-1，wavelength of detection was 322 nm.The Coumarin was used as inner standard.Results The detection limit of FA was 0.25 ng，and the lowest detectable concentration of FA was 5 ng·mL-1，with a linearity of 26.4-4224 ng·mL-1，r=0.9999.The mean recovery rate of FA was 98.17％±1.26％.Conclusion This method is sensitive，fast，simple，specific and reproducible.It can be used to the analysis of FA in serum and the study of pharmacokinetics.

Key words:DACHUANXIONGWAN；ferulic acid；serum；rabbit；HPLC

收稿日期 ２００８－０１－３０修回日期 ２００８－０２－２８

基金項目 國家973項目：方劑現代科學研究—方劑作用機理與物質基礎的研究，項目編號G1999054402.

作者簡介 王 興(１９７３－ ）男，成都市人，教授，博士后。主要研究方向：中藥多靶點藥理基因表達差異譜及中藥新藥研究。E-mail:wshing@263.net大川芎丸出自金·劉完素《宣明論方》卷二，用于治療“首風，旋暈眩急，外合陽氣，風寒相搏，胃膈痰飲，偏正頭痛，身拘倦。”是治療偏頭痛的傳統方劑。大川芎丸的現代研究始于國家“九五”攻關，對這樣一個傳統中藥復方進行現代化研究，明確它的物質基礎和作用機理，已成為“973”國家重點基礎發展規劃項目之一。該項目前期研究表明，阿魏酸（FA）有明顯的抗血小板釋放5-HT作用，是方中的主要有效成分［1］。為進行大川芎丸的復方效應成分藥動學研究，我們在文獻報道的基礎上建立了用改良水浴法去除血清蛋白，測定家兔服用大川芎丸后血清中的阿魏酸（FA）的含量，首次成功的研究了家兔服用大川芎丸后體內FA的藥代動力學參數。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

惠普公司高效液相色譜（HPLC）系統，Agilent 1100型，VWD紫外檢測器；LD4-2型低速離心機，北京醫用離心機廠；TGL-16G型臺式高速離心機，上海醫用分析儀器廠；電熱恒溫水浴鍋；XK96-A型快速混勻器，江蘇姜堰市新康儀器廠；GB204型萬分之一電子天平，瑞士生產。王興.健康家兔服用大川芎丸后體內阿魏酸的藥代動力學研究

成都醫學院學報2008年3月，3(1)

1.2 試藥與試劑

阿魏酸對照品（批號：0773-9910），中國藥品生物制品檢定所提供；香豆精對照品（批號8806615），含量99%，mp68.9℃～70.0℃，購于中國醫藥公司北京采購供應站；大川芎丸標準提取物１號樣（川芎∶天麻＝4∶1，0.867g膏/g生藥），由中國中醫研究院中藥所提供；醋酸、甲醇、冰乙酸均為AR級，水為雙重蒸餾水。

1.3 實驗動物

健康成年家兔，體重2.3 kg～2.9 kg，雌雄各半；由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.4 標準溶液的配制

定性用FA標準溶液的配制：用電子天平精密稱取4 mg FA標準品，置一10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微量移液器吸取10 μL置于1.5 mL離心管中，用甲醇稀釋至1 000 μL，搖勻，即標準液濃度為4 ng·μL-1。制作標準曲線用FA標準溶液及內標香豆精溶液的配制：精密稱取FA 6.6 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度為母液1（132 μg·mL-1）。母液1稀釋10倍后為母液2（13.2 μg·mL-1），母液2稀釋10倍為母液3（1.32 μg·mL-1）。精密稱取香豆精5.03 mg于100 mL棕色容量瓶中，加0.3 mL甲醇助溶后用雙蒸水稀釋至刻度（50.3 μg·mL-1）為母液4.上述配制好的標準溶液密封后置4℃冰箱待用［2］。

1.5 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）；流動相：甲醇∶水∶冰乙酸（49∶50.745∶0.255，V/V）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長：322 nm；進樣量：20 μL.

1.6 樣品預處理及測定

用微量移液器精密吸取0.5 mL空白兔血清置于一干凈的5 mL 玻璃具塞錐形離心試管中，加入30 μL蒸餾水，再加入100 μL FA（4 ng·μL-1）標準液，加入10 μL香豆精內標液，渦旋混勻15 s，100℃水浴10 min，用超微型攪拌器攪拌1 min制成勻漿，置低速離心機中離心20 min，3 500 r/min，吸取上清液后再加入等量甲醇，渦旋混勻15 s，用氮氣流吹干，再加300 μL甲醇復溶，置臺式高速離心機中離心5 min，10 000 r/min ，吸取上清液，取20 μL直接進行HPLC測定［3～5］，以峰面積進行定量分析。

2 結果

2.1 方法學研究

在本色譜條件下，阿魏酸、內標香豆精與血清中的雜質峰均作到基線分離，與血清峰無重合，樣品峰與雜質峰的分離度＞1.5，見圖1.

2.2 血清中阿魏酸標準曲線的制備及其最低血清檢測濃度的測定于8支尖底離心試管中分別加入不同的FA標準液，分別精密加入0.5 mL空白兔血清，制成含FA分別為0.00 ng·mL-1、26.4 ng·mL-1、52.8 ng·mL-1、105.6 ng·mL-1、211.2 ng·mL-1、1 056 ng·mL-1、2 112 ng·mL-1、4 224 ng·mL-1的血清標準液，搖勻后按樣品預處理項下操作測定（n=6），以FA與內標面積之比對應濃度進行回歸，線性范圍是26.4～4 224 ng·mL-1，進樣量為20 μL.得回歸方程［6，7］：Y=1 350.635 X-87.445 7，r=0.999 9，表明在26.4～4 224 ng·mL-1范圍內線性關系良好。當S/N>3時，FA檢測限為0.25 ng，按照樣品預處理方法處理后，測得最低血清檢測濃度為5 ng·mL-1。

2.3 回收率與精密度實驗

FA 3種濃度按樣品預處理項和標準曲線項下處理和測定，以加入已知量為理論值，實際測得面積比代入回歸方程中計算值為測定值，二者相比求得相對回收率和日內精密度。取同一批樣品，不同天數測定，同法求得日間精密度。

實驗結果見表1、表2.表1 FA在血清測定的方法回收率 表2 FA在血清測定的精密度

2.4 阿魏酸在家兔體內藥代動力學研究

大川芎丸日服劑量為35 g生藥，正常成年人體重按60 kg計算，即0.5833 g生藥·kg-1體重，家兔灌胃量為人臨床用藥量的20倍，即11.667g生藥/kg體重。健康成年家兔10只（n=10），雌雄各半，灌胃前禁食不禁水24h，取空白血清，然后按每只體重灌胃大川芎丸標準提取物5號樣后于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min各取血1 mL，分別離心得血清0.5 mL，這些樣品除不加阿魏酸標準液外均同樣采用前述樣品預處理方法進行樣品預處理［8］。進樣20 μL.測得家兔服用大川芎丸浸膏后阿魏酸的經時血藥濃度，結果見圖2.

2.5 數據分析

采用中國藥理學會3P97藥動學軟件，在計算機上進行計算并擬合判別。綜合判斷，家兔口服大川芎丸標準提取物后體內阿魏酸的分布及代謝屬于二室模型。其藥動學參數見表3. 表3 家兔服用大川芎丸后阿魏酸藥動學參數

3 討論

3.1 中藥藥代動力學研究中，多以中藥的單體成分進行藥代動力學研究，這顯然不能代表整個中藥方劑的體內過程。中藥效應成分動力學是比較適合中藥藥動學研究的方法，但目前報道的中藥復方效應成分動力學研究還較少。作者首次對大川芎丸進行了中藥復方效應成分動力學研究，由藥動學參數可知，家兔ig大川芎丸后其效應成分阿魏酸自胃腸道吸收非常迅速，分布較快，這為大川芎丸服用后可迅速緩解偏頭痛癥狀提供了依據。

3.2 在藥動學方法學研究中，作者采用了改良水浴法。水浴法具有步驟簡單、誤差小、無毒、費用低廉、高效等特點，但是該方法對色譜柱有很大的損傷，影響色譜柱的壽命。改良水浴法在水浴法的基礎上采取N2吹干后甲醇復溶的方法，又可除去大量蛋白沉淀，不僅使色譜圖中血清峰的干擾減少，同時也對色譜柱起到了很好的保護作用，使色譜柱的使用壽命延長。

3.3 阿魏酸是大川芎丸中主藥川芎的有效成分之一，具有明顯的抗血小板釋放5-HT作用。但是僅通過阿魏酸的藥動學研究還不能完全反映大川芎丸的體內過程，還需對方中的其它有效成分如川芎嗪、天麻素等進行體內變化規律的研究。

【參考文獻】 ［1］楊奎，周明眉，姜遠平.川芎嗪、阿魏酸對血小板釋放5-HT的影響［J］.中藥藥理與臨床，2000，16(增刊): 18. ［2］胡瑞娟，王興，黃熙.健康家兔服用大川芎丸后血清中阿魏酸的RP-HPLC測定方法［J］.成都中醫藥大學學報，2003，26（2）：31-33. ［3］黃熙，任平，張莉.HPLC直接測定血清中的阿魏酸—方劑血樣預處理新方法（Ⅰ）［J］.中草藥，1999，30（3）：175-178. ［4］黃熙，陳可冀，任平.高效液相色譜直接測定沸水浴處理人血清中冠心Ⅱ號來源的阿魏酸［J］.中國中西醫結合雜志，1999，19（2）：71-74. ［5］常子軍，張莉，黃熙.健康人服用黃芪當歸合劑后體內阿魏酸的HPLC法測定［J］. 南京中醫藥大學學報（自然科學版），2002，18（2）：100-102. ［6］王驪驪，黃熙，任平.反相高效液相色譜法測定冠心Ⅱ號湯劑中芍藥甙和阿魏酸的含量［J］.成都中醫藥大學學報，2001，24（1）：51-52. ［7］常明向，徐蓮英，陶建生.阿魏酸納大鼠體內藥物動力學研究［J］.西北藥學雜志， 1995，10（2）：81-83. ［8］尚剛偉，黃熙，蔣永培.正常人口服川芎單煎湯劑后體內阿魏酸的藥代動力學研究［J］.中藥藥理與臨床，1999，12（6）：38-40.