作者：陳武，周洪亮1王海丹1劉志輝

【摘要】 目的 采用多藥效學(xué)指標(biāo)確定烏鱉顆粒中黃狗腎的提取工藝。方法 比較黃狗腎95%乙醇提取和70%乙醇提取兩種工藝對(duì)卵巢摘除大鼠雌激素活性以及對(duì)幼鼠子宮、卵巢發(fā)育的影響。結(jié)果 兩種提取工藝的提取物均可使卵巢摘除大鼠血清雌二醇水平增高;95%乙醇工藝提取還具有提高大鼠雌激素活性及促進(jìn)幼鼠子宮、卵巢生長(zhǎng)的作用。結(jié)論 烏鱉顆粒中黃狗腎飲片應(yīng)采用95%乙醇提取。

【關(guān)鍵詞】 烏鱉顆粒;黃狗腎;提取工藝;多藥效學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)

Abstract：Objective To define the extraction process of Dog Penis in Wubie Granules by multiple pharmacodynamics indicators. Methods Rat ovaries were removed by operation. The effect of 95% alcohol extraction and 70% alcohol extraction were compared on uterus and ovaries development of immature mice and estrogen activity of rats with operation. Results Products of both processes could raise E2 level in serum of rats with operation， 95% alcohol extraction could also enhance estrogen activity of rats and develop uterus and ovaries of immature mice. Conclusion Dog Penis in Wubie Granules should be extracted by 95% alcohol.

Key words：Wubie Granules;Dog Penis;extraction process;multiple pharmacodynamics index evaluation

烏鱉顆粒來(lái)源于江蘇省中醫(yī)院名老中醫(yī)夏桂成教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃狗腎、制何首烏和鱉甲等7味藥組成，臨床上用于治療卵巢功能早衰。黃狗腎為犬科動(dòng)物狗Canis familiaris L.的干燥陰莖和睪丸，具有暖腎、壯陽(yáng)、益精功效[1]。目前黃狗腎文獻(xiàn)報(bào)道比較少，物質(zhì)基礎(chǔ)研究薄弱，有效成分尚不明確，為保證制劑療效，筆者采用多藥效學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)方法對(duì)黃狗腎提取工藝進(jìn)行探索。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雌性SD大鼠，體重120～140 g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033。ICR小鼠，體重14～18 g，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇) 2007-0001。

1.2 儀器

SP-756PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);LDZ5-2型離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司);r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司);FA1004電子分析天平(上海精科天平廠)。

1.3 藥物與試劑

六味地黃丸(河南宛西制藥股份有限公司，批號(hào)090872)。黃狗腎及方中飲片均購(gòu)于江蘇省醫(yī)藥公司，經(jīng)鑒定符合相關(guān)要求。紅四氮唑(TTC，上海試劑三廠，批號(hào)961115);四氯乙烯(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)20010203);無(wú)水乙醇(上海久億化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20090210)。雌二醇(E2)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)20091128);促卵泡激素(FSH)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)20091128);黃體生成素(LH)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)20091128)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備方法

工藝A提取液：按處方比例稱取飲片，黃狗腎加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次1 h，濾過(guò)，藥液與藥渣備用;枸杞子、茯苓加10倍量水煎煮2次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.20(60 ℃測(cè))的浸膏，備用;黃狗腎藥渣與方中其他飲片加10倍量水煎煮2次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.15(80 ℃測(cè))，加乙醇至含量為60%，靜置48 h，抽濾，濾液與黃狗腎液合并回收乙醇至盡，再與枸杞子、茯苓提取液合并即得。

工藝B提取液：按處方比例稱取飲片，黃狗腎加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，濾過(guò)，藥液與藥渣備用;其余6味飲片的處理同工藝A。

陽(yáng)性對(duì)照液：取六味地黃丸搗碎，研成粉狀，然后加入蒸餾水混溶，即得。

陰性對(duì)照液：按處方比例稱取飲片(缺黃狗腎)，飲片的處理同工藝A。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用—(—用)±s表示，采用t檢驗(yàn)，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 對(duì)卵巢摘除大鼠雌激素活性的影響

取雌性SD大鼠85只，除正常對(duì)照組10只外，其余75只去除雙側(cè)卵巢，手術(shù)后2周，將手術(shù)成功的大鼠隨機(jī)分組，每組10只。各組按下述劑量每日灌胃給予相應(yīng)藥物1次，正常對(duì)照組和模型組：等量生理鹽水;陽(yáng)性對(duì)照組：3 g/kg六味地黃丸;工藝A組：11 g/kg;工藝B組：11 g/kg;陰性對(duì)照組：11 g/kg。每日灌胃1次，連續(xù)給藥4周。末次給藥30 min后，每鼠陰道內(nèi)緩緩注入新鮮配制的25 mg/mL TTC水溶液0.1 mL，于陰道內(nèi)停留30 min，取血，離心，取血清測(cè)E2、FSH、LH水平。立即處死，剪取大鼠陰道，縱行切開(kāi)，分離陰道，剪碎后置離心試管中，加入無(wú)水乙醇和四氯乙烯混合溶液4 mL，浸泡提取2 h， 2 000 r/min離心5 min。吸取上清液，以無(wú)水乙醇和四氯乙烯混合液作空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)定A值[2-4]。

結(jié)果表明，工藝A組和工藝B組均可使卵巢摘除大鼠血清E2水平增高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示工藝A組和工藝B組具有調(diào)節(jié)機(jī)體激素水平的作用。工藝A組的OD值與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示工藝A組可明顯增加大鼠陰道角化上皮細(xì)胞，具有提高雌激素活性的作用。見(jiàn)表1、表2。表1 對(duì)卵巢摘除大鼠血清E2、FSH、LH活性的影響(—(—的)±s)表2 對(duì)卵巢摘除大鼠雌激素活性的影響(—(—巢)±s)

2.4 對(duì)幼鼠子宮、卵巢發(fā)育的影響

取未成熟ICR健康雌性幼鼠(體重14～18 g)60只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(灌胃等量生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(4.5 g/kg)、工藝A組(16.5 g/kg)、工藝B組(16.5 g/kg)、陰性對(duì)照組(16.5 g/kg)。各組均灌胃給予相應(yīng)藥物，劑量0.2 mL/10 g， 1次/d×10 d。末次給藥后12 h，脫頸椎處死，解剖，取子宮、卵巢、脾、胸腺，分離脂肪，迅速以電子天平稱重。計(jì)算脾、胸腺、卵巢、子宮系數(shù) [2]。結(jié)果表明，工藝A組促進(jìn)子宮、卵巢和胸腺生長(zhǎng)，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示工藝A組具有促進(jìn)子宮、卵巢發(fā)育的作用。見(jiàn)表3。表3 對(duì)幼鼠子宮、卵巢、脾、胸腺發(fā)育的影響(—(—鼠)±s)

3 討論

鞭類中藥飲片的服用方法主要包括研粉吞服、煮食和泡酒內(nèi)服。譚氏等[5]研究結(jié)果表明，狗鞭(黃狗腎)飲片勻漿后的混懸液對(duì)腎陽(yáng)虛型動(dòng)物有不同程度的壯陽(yáng)作用;文獻(xiàn)報(bào)道其主要含雄性激素、蛋白質(zhì)、維生素E、脂肪和有機(jī)纖維等成分[6]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，烏鱉顆粒中黃狗腎不同乙醇濃度提取工藝(工藝A和工藝B)的提取物均可使卵巢摘除大鼠血清E2水平增高;此外，用95%乙醇提取工藝(工藝A)制備的提取物還具有較好的提高大鼠雌激素活性，促進(jìn)子宮、卵巢生長(zhǎng)的作用，這與烏鱉顆粒治療卵巢功能早衰目的一致。綜合上述分析，方中黃狗腎飲片應(yīng)用95%乙醇提取。

提取黃狗腎所用乙醇濃度不同，對(duì)藥效的影響也不同，濃度高者藥效明顯好，這是否提示黃狗腎中極性較低的成分是其有效成分，有待進(jìn)一步研究。