作者：邱召娟，朱萱萱，倪文澎，嚴士海，朱瓊

【摘要】 目的研究銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒（B/京防98-96）的抑制作用。方法體外接種乙型流感病毒鼠肺適應株于狗腎細胞(MDCK)，觀察銀荊感冒顆粒體外抗病毒作用；體內實驗①以乙型流感病毒鼠肺適應株滴鼻感染小鼠，觀察14 d，計算小鼠存活率及存活天數；體內實驗②以乙型流感病毒鼠肺適應株滴鼻感染小鼠，觀察肺指數。結果銀荊感冒顆粒體外抗乙型流感病毒EC50為3.68 mg/ml。銀荊感冒顆粒10 g/kg和20 g/kg劑量組可明顯延長乙型流感病毒感染小鼠存活天數，降低死亡率；銀荊感冒顆粒20 g/kg劑量組可明顯抑制肺指數值，抑制率為36.7%。結論 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒有一定的抑制作用。

【關鍵詞】 銀荊感冒顆粒 乙型流感病毒 體內外 抑制

Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus. Methods The inhibitory cytopathic effects(CPE) of Yinjingganmao granule were observed by MDCK cell culture. The experiment in vivo were done by the following two methods：(1) The mice were given Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the survival rate and days of mice 14 days later. (2) The mice were given intragastrically Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the lung index and observed the pathological change. ResultsThe EC50 of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus was 3.68mg/ml. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could prolong the survival days and reduce the death rate significantly. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could inhibit the lung index of the infected mice and the inhibition ratio was 31.4 and 29.1% respectively. In addition， it could also lessen the pathological change.Conclusion：Yinjingganmao granule has inhibitory effect on Influenza B Virus.

Key wordsYinjingganmao granule; Influenza B Virus; In vivo and vitro; Inhibition

流行性感冒是上呼吸道傳染性極強的病毒感染性疾病，在呼吸系統中發病率占首位，可引起許多并發癥，重者可引起死亡。我們運用現代工藝，選用古方銀翹散結合臨床化裁而制成銀荊感冒顆粒，作為本院院內制劑，在臨床上取得了良好療效。為了探索該顆粒劑治療流行性感冒的機制，我們選擇與呼吸道有關的乙型流感病毒，以該病毒感染小鼠為藥物評價模型，通過感染小鼠存活率、存活天數、肺指數值與肺病理變化為指標來評價藥效，同時結合體外實驗，來觀察銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒引起的細胞病變的作用。

1 材料與儀器

1.1 藥物及試劑銀荊感冒顆粒，江蘇省中醫院藥劑科提供，批號050424；利巴韋林注射液，四川美大康藥業股份有限公司，批號050316；RPMI Medium 1640，GIBCO公司；胰蛋白酶，上海伯奧生物技術有限公司，批號020602；HEPES，江蘇科威技術服務有限公司，批號H3375；磷酸氫二鈉，南京化學試劑廠，批號051207；磷酸二氫鉀，廣西西隴化工廠， 批號041119；碳酸氫鈉，上海虹光化工廠，批號050622；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號050827；青霉素，山東魯抗醫藥股份有限公司，批號8040613；鏈霉素，大連美羅大藥廠，批號040707；乙醚，南京試劑廠，批號050628。

1.2 儀器

CO2培養箱（BB16）， Beracus公司；倒置顯微鏡（XSZ-D2），重慶光學儀器廠；微孔濾器，上海醫藥工業研究院；細胞培養板，丹麥NUNC公司；凈化工作臺（SW-CJ-IF）蘇州安泰空氣技術有限公司；FA1004型電子分析天平，上海精科天平廠。

1.3 病毒株及細胞株

乙型流感病毒 B/京防98-96，購自中國預防醫學科學院病毒所，由江蘇省中醫院臨床研究所藥理實驗室傳代后-70℃低溫冰箱保存備用；狗腎細胞(MDCK)，購自上海細胞所。

1.4 動物ICR小鼠，♀♂兼用，體重16～24 g，由南京青龍山動物飼養廠提供，合格證號：SCZK（蘇）2001-0018。

2 方法

2.1 銀荊感冒顆粒體外對乙型流感病毒的作用

2.1.1 MDCK細胞培養新購置的MDCK細胞，用0.25%的胰酶消化，然后加入含血清培養液適量，輕輕吹打均勻，按1∶3比例進行分瓶傳代。實驗前則接細胞于96孔培養板中，培養24 h后，用于實驗。

2.1.2 病毒毒力測定將凍存的病毒液快速凍融后，按10倍稀釋法稀釋成10-1～10-9的不同稀釋液，接種到MDCK細胞培養板中，每個濃度4個孔，每孔接種150 μl病毒液，于5%CO2，37℃靜置培養，同時設正常細胞對照，4個復孔，觀察細胞病變情況，以CPE不再進展時，按Reed-Muench氏法［1］計算病毒滴度，即該病毒的TCID50。CPE程度：－，無細胞病變；+，25%細胞病變；＋＋，50%細胞病變；＋＋＋，75%細胞病變；＋＋＋＋，100%細胞病變。

2.1.3 銀荊感冒顆粒最大無毒濃度實驗銀荊感冒顆粒（浸膏），每毫升相當于4.9 g藥材，首先將原浸膏稀釋成1 g/ml，再用完全培養液稀釋成100 mg/ml，最后用完全培養液將其分別稀釋成80，40，20，10，5，2.5 mg/ml的不同濃度加入長成單層MDCK細胞的96孔培養板中，每個濃度4個復孔，每孔150 μl同時設立正常細胞對照組，置培養箱中培養，觀察細胞的生長情況，觀察病變情況，以不出現細胞變暗、變圓、融合、脫落等病變的最大藥物濃度為該藥物的無毒性濃度。

2.1.4 銀荊感冒顆粒TC50測定根據最大無毒濃度實驗結果，將銀荊感冒顆粒稀釋成不同濃度，加入長成單層MDCK細胞的96孔板，每個濃度4個復孔，150 μl/孔，同時設立正常的細胞對照組，置培養箱中培養，觀察細胞的生長情況，觀察病變情況，采用孫氏綜合法［2］計算該藥物對細胞的TC50［2］。CPE程度：－，無細胞病變；+，25%細胞病變；＋＋，50%細胞病變；＋＋＋，75%細胞病變；＋＋＋＋，100%細胞病變。

2.1.5 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒的作用已長成單層的細胞接種劑量為10 TCID50的病毒，置37℃，5%CO2溫箱孵育2 h，棄去含病毒維持液，更換含不同濃度藥物的維持液，置培養箱內培養。每天觀察細胞形態，連續觀察3 d，記錄CPE程度，同時設立正常細胞對照組、病毒對照組各四孔，采用孫氏綜合法計算藥物半數有效濃度(EC50)和治療指數(TI)。治療指數(TI)=TC50/EC50。CPE程度：－，無細胞病變；+，25%細胞病變；＋＋，50%細胞病變；＋＋＋，75%細胞病變；＋＋＋＋，100%細胞病變。

2.2 銀荊感冒顆粒體內對乙型流感病毒的作用

2.2.1 病毒感染小鼠半數致死量（LD50）測定方法見參考文獻［1］。

2.2.2 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護作用取ICR小鼠120只，體重13～16 g，♀♂各半，隨機分6組，每組20只：①空白對照組，等量生理鹽水；②模型組，等量生理鹽水；③利巴韋林組，75 mg/kg；④銀荊感冒顆粒Ⅰ組，5 g/kg；⑤銀荊感冒顆粒Ⅱ組，10 g/kg；⑥銀荊感冒顆粒Ⅲ組，20 g/kg。以上各組均灌胃給藥，給藥容量10 ml/kg，1次/d×5 d 。于給藥第2天各小鼠（除空白對照組外）在乙醚麻醉下，以血凝試驗640以上的尿囊液給小鼠滴鼻感染，每鼠30 μl（20個LD50致死量）觀察感染后發病及死亡情況，每日記錄動物的死亡情況，連續2周。

2.2.3 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒感染小鼠肺指數取ICR小鼠60只，體重13～16 g，♀♂各半，隨機分6組，每組10只：①正常組，等量生理鹽水； ②病毒對照組，等量生理鹽水；③利巴韋林組，75 mg/kg；④銀荊感冒顆粒Ⅰ組，5 g/kg；⑤銀荊感冒顆粒Ⅱ組，10 g/kg；⑥銀荊感冒顆粒Ⅲ組，20 g/kg；以上各組動物均灌胃給藥，灌胃容量10 ml/kg，1次/d×5 d。于給藥第2天各組動物（除空白對照組外）在乙醚麻醉下，用增毒3次尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30 μl（20個LD50致死量），實驗前禁食不禁水，末次給藥后，實驗當日各組小鼠稱重，脫頸椎處死取全肺稱重，計算各鼠肺指數及肺指數抑制率，比較各組間差異。肺指數（%）=小鼠肺重（g）/小鼠體重（g）×100%；肺指數抑制率（%）=對照組平均肺指數-實驗組平均肺指數/對照組平均肺指數×100%。

2.3 統計方法數據處理運用SPSS13.0軟件完成，組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 銀荊感冒顆粒體外對乙型流感病毒的作用

3.1.1 病毒毒力測定結果為了解乙型流感病毒在MDCK細胞中的毒力情況， 確定體外抗病毒藥效學實驗中病毒的攻擊量。根據所得數據，采用Reed-Muench法計算TCID50為10-3.67。

3.1.2 銀荊感冒顆粒毒性實驗測定結果為了解銀荊感冒顆粒在MDCK細胞中的毒性作用，確定實驗中藥物劑量，。根據所得數據， 銀荊感冒顆粒最大無毒濃度為20 mg/ml；采用孫氏綜合法計算TC50為26.94 mg/ml。

3.1.3 銀荊感冒顆粒體外對乙型流感病毒作用有良好的抑制作用，其EC50為3.68 mg/ml。TI為8.31。

3.2 銀荊感冒顆粒體內對乙型流感病毒的作用

3.2.1 病毒感染小鼠半數致死量（LD50）測定為了了解乙型流感病毒感染小鼠的死亡情況，確定體內實驗乙型流感病毒感染小鼠的量。按孫氏綜合法計算LD50是10-2.23。

3.2.2 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護作用結果見表1。表1 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護作用(略)

實驗結果提示：銀荊感冒顆粒10 g/kg和20 g/kg劑量組可明顯減少乙型流感病毒感染小鼠的死亡率，并可延長存活天數，與模型組比較具有顯著性差異，提示銀荊感冒顆粒具有抗乙型流感病毒的作用。

3.2.3 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒感染小鼠肺指數的影響結果見表2。表2 銀荊感冒顆粒對乙型流感病毒感染小鼠肺指數的影響（略）

實驗結果提示:銀荊感冒顆粒20 g/kg劑量組對乙型流感感染小鼠肺指數抑制率為36.7%，與模型比較具有顯著性差異。提示：銀荊感冒顆粒可減輕乙型流感病毒對肺部的感染，具有抗乙型流感病毒的作用。

4 討論

流行性感冒由流感病毒引起，目前，國際上防治流感的方法是接種減毒活疫苗和使用化學藥物治療，但由于流感病毒容易發生抗原變異，使疫苗保護作用效果受到一定限制，而使用的化學藥物又有較大的不良反應，因此到目前為止還沒有有效防治流感的方法［3］。中醫認為流行性感冒是外感六淫，時行病毒所致。以風為主因，風為六淫之首，但在不同季節，往往與其它當令之時氣相合而傷人。一般以風熱為多見，銀荊感冒顆粒由金銀花、連翹、荊芥、板藍根，防風和薄荷組成，是銀翹散結合臨床經驗化裁而成，方中金銀花味甘，性寒，連翹味苦，性微寒，甘苦相合為君藥，既有辛涼透邪清熱之效，又有芳香辟穢解毒之功；荊芥味辛，性溫，助君藥辛開皮毛而散邪，板藍根苦寒助君藥清熱解毒，共為臣藥；防風、薄荷加強辛散泄熱。對風熱感冒發熱、咽痛、周身酸痛、咳嗽等癥有良好的治療作用。我們通過體內外實驗初步證實了銀荊感冒顆粒確有抗乙型流感病毒的作用。

【參考文獻】 ［1］杜平.醫用實驗病毒學［M］.北京：人民軍醫出版社，1985：80，107. ［2］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛生出版社，2006：113. ［3］Luscher-Mattli M. Influenza chemotherapy: a review of the present state of art and of new drugs in development［J］. Arch Virol，2000，145：2233.