作者：邱召娟，朱萱萱，倪文澎，嚴(yán)士海，朱瓊

【摘要】 目的研究銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒（B/京防98-96）的抑制作用。方法體外接種乙型流感病毒鼠肺適應(yīng)株于狗腎細(xì)胞(MDCK)，觀察銀荊感冒顆粒體外抗病毒作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)①以乙型流感病毒鼠肺適應(yīng)株滴鼻感染小鼠，觀察14 d，計(jì)算小鼠存活率及存活天數(shù)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)②以乙型流感病毒鼠肺適應(yīng)株滴鼻感染小鼠，觀察肺指數(shù)。結(jié)果銀荊感冒顆粒體外抗乙型流感病毒EC50為3.68 mg/ml。銀荊感冒顆粒10 g/kg和20 g/kg劑量組可明顯延長(zhǎng)乙型流感病毒感染小鼠存活天數(shù)，降低死亡率；銀荊感冒顆粒20 g/kg劑量組可明顯抑制肺指數(shù)值，抑制率為36.7%。結(jié)論 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒有一定的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 銀荊感冒顆粒 乙型流感病毒 體內(nèi)外 抑制

Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus. Methods The inhibitory cytopathic effects(CPE) of Yinjingganmao granule were observed by MDCK cell culture. The experiment in vivo were done by the following two methods：(1) The mice were given Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the survival rate and days of mice 14 days later. (2) The mice were given intragastrically Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the lung index and observed the pathological change. ResultsThe EC50 of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus was 3.68mg/ml. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could prolong the survival days and reduce the death rate significantly. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could inhibit the lung index of the infected mice and the inhibition ratio was 31.4 and 29.1% respectively. In addition， it could also lessen the pathological change.Conclusion：Yinjingganmao granule has inhibitory effect on Influenza B Virus.

Key wordsYinjingganmao granule; Influenza B Virus; In vivo and vitro; Inhibition

流行性感冒是上呼吸道傳染性極強(qiáng)的病毒感染性疾病，在呼吸系統(tǒng)中發(fā)病率占首位，可引起許多并發(fā)癥，重者可引起死亡。我們運(yùn)用現(xiàn)代工藝，選用古方銀翹散結(jié)合臨床化裁而制成銀荊感冒顆粒，作為本院院內(nèi)制劑，在臨床上取得了良好療效。為了探索該顆粒劑治療流行性感冒的機(jī)制，我們選擇與呼吸道有關(guān)的乙型流感病毒，以該病毒感染小鼠為藥物評(píng)價(jià)模型，通過感染小鼠存活率、存活天數(shù)、肺指數(shù)值與肺病理變化為指標(biāo)來評(píng)價(jià)藥效，同時(shí)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，來觀察銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒引起的細(xì)胞病變的作用。

1 材料與儀器

1.1 藥物及試劑銀荊感冒顆粒，江蘇省中醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)050424；利巴韋林注射液，四川美大康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)050316；RPMI Medium 1640，GIBCO公司；胰蛋白酶，上海伯奧生物技術(shù)有限公司，批號(hào)020602；HEPES，江蘇科威技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)H3375；磷酸氫二鈉，南京化學(xué)試劑廠，批號(hào)051207；磷酸二氫鉀，廣西西隴化工廠， 批號(hào)041119；碳酸氫鈉，上海虹光化工廠，批號(hào)050622；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)050827；青霉素，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)8040613；鏈霉素，大連美羅大藥廠，批號(hào)040707；乙醚，南京試劑廠，批號(hào)050628。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱（BB16）， Beracus公司；倒置顯微鏡（XSZ-D2），重慶光學(xué)儀器廠；微孔濾器，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；細(xì)胞培養(yǎng)板，丹麥NUNC公司；凈化工作臺(tái)（SW-CJ-IF）蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FA1004型電子分析天平，上海精科天平廠。

1.3 病毒株及細(xì)胞株

乙型流感病毒 B/京防98-96，購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所，由江蘇省中醫(yī)院臨床研究所藥理實(shí)驗(yàn)室傳代后-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫还纺I細(xì)胞(MDCK)，購(gòu)自上海細(xì)胞所。

1.4 動(dòng)物ICR小鼠，♀♂兼用，體重16～24 g，由南京青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)廠提供，合格證號(hào)：SCZK（蘇）2001-0018。

2 方法

2.1 銀荊感冒顆粒體外對(duì)乙型流感病毒的作用

2.1.1 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)新購(gòu)置的MDCK細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，然后加入含血清培養(yǎng)液適量，輕輕吹打均勻，按1∶3比例進(jìn)行分瓶傳代。實(shí)驗(yàn)前則接細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，用于實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 病毒毒力測(cè)定將凍存的病毒液快速凍融后，按10倍稀釋法稀釋成10-1～10-9的不同稀釋液，接種到MDCK細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度4個(gè)孔，每孔接種150 μl病毒液，于5%CO2，37℃靜置培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，4個(gè)復(fù)孔，觀察細(xì)胞病變情況，以CPE不再進(jìn)展時(shí)，按Reed-Muench氏法［1］計(jì)算病毒滴度，即該病毒的TCID50。CPE程度：－，無細(xì)胞病變；+，25%細(xì)胞病變；＋＋，50%細(xì)胞病變；＋＋＋，75%細(xì)胞病變；＋＋＋＋，100%細(xì)胞病變。

2.1.3 銀荊感冒顆粒最大無毒濃度實(shí)驗(yàn)銀荊感冒顆粒（浸膏），每毫升相當(dāng)于4.9 g藥材，首先將原浸膏稀釋成1 g/ml，再用完全培養(yǎng)液稀釋成100 mg/ml，最后用完全培養(yǎng)液將其分別稀釋成80，40，20，10，5，2.5 mg/ml的不同濃度加入長(zhǎng)成單層MDCK細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，每孔150 μl同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照組，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，觀察病變情況，以不出現(xiàn)細(xì)胞變暗、變圓、融合、脫落等病變的最大藥物濃度為該藥物的無毒性濃度。

2.1.4 銀荊感冒顆粒TC50測(cè)定根據(jù)最大無毒濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將銀荊感冒顆粒稀釋成不同濃度，加入長(zhǎng)成單層MDCK細(xì)胞的96孔板，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，150 μl/孔，同時(shí)設(shè)立正常的細(xì)胞對(duì)照組，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，觀察病變情況，采用孫氏綜合法［2］計(jì)算該藥物對(duì)細(xì)胞的TC50［2］。CPE程度：－，無細(xì)胞病變；+，25%細(xì)胞病變；＋＋，50%細(xì)胞病變；＋＋＋，75%細(xì)胞病變；＋＋＋＋，100%細(xì)胞病變。

2.1.5 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒的作用已長(zhǎng)成單層的細(xì)胞接種劑量為10 TCID50的病毒，置37℃，5%CO2溫箱孵育2 h，棄去含病毒維持液，更換含不同濃度藥物的維持液，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)觀察3 d，記錄CPE程度，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組各四孔，采用孫氏綜合法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)和治療指數(shù)(TI)。治療指數(shù)(TI)=TC50/EC50。CPE程度：－，無細(xì)胞病變；+，25%細(xì)胞病變；＋＋，50%細(xì)胞病變；＋＋＋，75%細(xì)胞病變；＋＋＋＋，100%細(xì)胞病變。

2.2 銀荊感冒顆粒體內(nèi)對(duì)乙型流感病毒的作用

2.2.1 病毒感染小鼠半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定方法見參考文獻(xiàn)［1］。

2.2.2 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用取ICR小鼠120只，體重13～16 g，♀♂各半，隨機(jī)分6組，每組20只：①空白對(duì)照組，等量生理鹽水；②模型組，等量生理鹽水；③利巴韋林組，75 mg/kg；④銀荊感冒顆粒Ⅰ組，5 g/kg；⑤銀荊感冒顆粒Ⅱ組，10 g/kg；⑥銀荊感冒顆粒Ⅲ組，20 g/kg。以上各組均灌胃給藥，給藥容量10 ml/kg，1次/d×5 d 。于給藥第2天各小鼠（除空白對(duì)照組外）在乙醚麻醉下，以血凝試驗(yàn)640以上的尿囊液給小鼠滴鼻感染，每鼠30 μl（20個(gè)LD50致死量）觀察感染后發(fā)病及死亡情況，每日記錄動(dòng)物的死亡情況，連續(xù)2周。

2.2.3 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)取ICR小鼠60只，體重13～16 g，♀♂各半，隨機(jī)分6組，每組10只：①正常組，等量生理鹽水； ②病毒對(duì)照組，等量生理鹽水；③利巴韋林組，75 mg/kg；④銀荊感冒顆粒Ⅰ組，5 g/kg；⑤銀荊感冒顆粒Ⅱ組，10 g/kg；⑥銀荊感冒顆粒Ⅲ組，20 g/kg；以上各組動(dòng)物均灌胃給藥，灌胃容量10 ml/kg，1次/d×5 d。于給藥第2天各組動(dòng)物（除空白對(duì)照組外）在乙醚麻醉下，用增毒3次尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30 μl（20個(gè)LD50致死量），實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水，末次給藥后，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日各組小鼠稱重，脫頸椎處死取全肺稱重，計(jì)算各鼠肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率，比較各組間差異。肺指數(shù)（%）=小鼠肺重（g）/小鼠體重（g）×100%；肺指數(shù)抑制率（%）=對(duì)照組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù)/對(duì)照組平均肺指數(shù)×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS13.0軟件完成，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 銀荊感冒顆粒體外對(duì)乙型流感病毒的作用

3.1.1 病毒毒力測(cè)定結(jié)果為了解乙型流感病毒在MDCK細(xì)胞中的毒力情況， 確定體外抗病毒藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中病毒的攻擊量。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50為10-3.67。

3.1.2 銀荊感冒顆粒毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果為了解銀荊感冒顆粒在MDCK細(xì)胞中的毒性作用，確定實(shí)驗(yàn)中藥物劑量，。根據(jù)所得數(shù)據(jù)， 銀荊感冒顆粒最大無毒濃度為20 mg/ml；采用孫氏綜合法計(jì)算TC50為26.94 mg/ml。

3.1.3 銀荊感冒顆粒體外對(duì)乙型流感病毒作用有良好的抑制作用，其EC50為3.68 mg/ml。TI為8.31。

3.2 銀荊感冒顆粒體內(nèi)對(duì)乙型流感病毒的作用

3.2.1 病毒感染小鼠半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定為了了解乙型流感病毒感染小鼠的死亡情況，確定體內(nèi)實(shí)驗(yàn)乙型流感病毒感染小鼠的量。按孫氏綜合法計(jì)算LD50是10-2.23。

3.2.2 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用結(jié)果見表1。表1 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用(略)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：銀荊感冒顆粒10 g/kg和20 g/kg劑量組可明顯減少乙型流感病毒感染小鼠的死亡率，并可延長(zhǎng)存活天數(shù)，與模型組比較具有顯著性差異，提示銀荊感冒顆粒具有抗乙型流感病毒的作用。

3.2.3 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響結(jié)果見表2。表2 銀荊感冒顆粒對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響（略）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:銀荊感冒顆粒20 g/kg劑量組對(duì)乙型流感感染小鼠肺指數(shù)抑制率為36.7%，與模型比較具有顯著性差異。提示：銀荊感冒顆粒可減輕乙型流感病毒對(duì)肺部的感染，具有抗乙型流感病毒的作用。

4 討論

流行性感冒由流感病毒引起，目前，國(guó)際上防治流感的方法是接種減毒活疫苗和使用化學(xué)藥物治療，但由于流感病毒容易發(fā)生抗原變異，使疫苗保護(hù)作用效果受到一定限制，而使用的化學(xué)藥物又有較大的不良反應(yīng)，因此到目前為止還沒有有效防治流感的方法［3］。中醫(yī)認(rèn)為流行性感冒是外感六淫，時(shí)行病毒所致。以風(fēng)為主因，風(fēng)為六淫之首，但在不同季節(jié)，往往與其它當(dāng)令之時(shí)氣相合而傷人。一般以風(fēng)熱為多見，銀荊感冒顆粒由金銀花、連翹、荊芥、板藍(lán)根，防風(fēng)和薄荷組成，是銀翹散結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而成，方中金銀花味甘，性寒，連翹味苦，性微寒，甘苦相合為君藥，既有辛涼透邪清熱之效，又有芳香辟穢解毒之功；荊芥味辛，性溫，助君藥辛開皮毛而散邪，板藍(lán)根苦寒助君藥清熱解毒，共為臣藥；防風(fēng)、薄荷加強(qiáng)辛散泄熱。對(duì)風(fēng)熱感冒發(fā)熱、咽痛、周身酸痛、咳嗽等癥有良好的治療作用。我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了銀荊感冒顆粒確有抗乙型流感病毒的作用。

【參考文獻(xiàn)】 ［1］杜平.醫(yī)用實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1985：80，107. ［2］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：113. ［3］Luscher-Mattli M. Influenza chemotherapy: a review of the present state of art and of new drugs in development［J］. Arch Virol，2000，145：2233.