【摘要】 烷化劑是用于治療惡性腦腫瘤的主要藥物，通過破壞DNA并誘導細胞凋亡對腫瘤細胞進行殺傷作用。內在性或獲得性的烷化劑耐藥是惡性腦腫瘤患者治療失敗的主要原因。烷化劑治療腦腫瘤受多種途徑調節影響：包括DNA修復途徑、堿基切除修復(BER)途徑等，對其影響途徑的研究有助于克服烷化劑耐藥，同時采用臨床前模型試驗有助于制訂有效治療方案克服耐藥及促進藥物開發。 【關鍵詞】 膠質瘤;烷化劑;耐藥;臨床前期模型試驗 烷化劑是用于治療惡性腦腫瘤的主要藥物，通過破壞DNA并誘導細胞凋亡對腫瘤細胞起殺傷作用。烷化劑包括卡莫司汀(亞硝基脲)、洛莫司汀(氯乙基亞硝基脲類)和替莫唑胺，容易穿過血-腦屏障作用于惡性膠質瘤。盡管這些藥物在大腦中可以達到有效治療濃度，但惡性膠質瘤常常發生耐藥。內在性或獲得性的烷化劑耐藥是惡性腦腫瘤患者治療失敗的主要原因。認識腫瘤的多種耐藥機制，制定有效的治療方案克服耐藥是臨床前期研究和臨床研究的焦點。烷化劑治療腦腫瘤受多種途徑調節影響：包括DNA修復途徑、堿基切除修復(BER)途徑等，對其影響途徑的研究有助于克服烷化劑耐藥，同時采用臨床前模型試驗有助于制訂有效治療方案克服耐藥及促進藥物開發。本文對惡性腦膠質瘤烷化劑耐藥機制及調節的研究進行綜述。 1耐藥機制 1.1O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)烷化劑的作用機制主要是攻擊細胞DNA，造成腫瘤細胞DNA烷基化損傷(包括甲基化、氯乙基化等)，進而形成DNA交聯，導致細胞死亡。烷化劑產生的烷基化損傷有12種，其中DNA中O6-甲基鳥嘌呤的烷基化損傷對細胞危害最大，其造成堿基錯誤配對，即G：C→A：T，進而形成鏈交聯和鏈斷裂，最終導致腫瘤細胞死亡。MGMT是一種普遍存在的DNA修復酶，主要通過不可逆地將烷化基團從O6-甲基鳥嘌呤轉移到自身蛋白，修復鳥嘌呤，使烷化劑耐藥。在人類腫瘤中，MGMT基因一般不通過突變失活，MGMT的功能喪失最常見的是由啟動子區域甲基化造成[1-2]。臨床前期研究表明，MGMT基因啟動子離散區域甲基化造成該基因的遺傳沉默、MGMT表達的失活，從而減少DNA修復。MGMT基因啟動子甲基化的腫瘤對烷化劑更加敏感，而MGMT啟動子未甲基化的腫瘤表達高水平酶活性，更耐烷化劑[3]。因此，通過對MGMT基因啟動子甲基化的檢測可預測烷化劑對腦腫瘤的耐藥情況[4]。臨床上檢測MGMT基因啟動子甲基化能夠指導腫瘤個體化治療及預見性化療。最近研究表明，在腦膠質瘤中，MGMT基因啟動子區CpG島甲基化發生率達到46%，啟動子區CpG島甲基化狀態與MGMT蛋白表達密切相關[4]。 1.2DNA錯配修復(MMR)途徑MMR途徑在調節O6-甲基鳥嘌呤的毒性殺傷作用中至關重要。人類的錯配修復基因主要有hMLH1、mutS homolog 2 (homosapiens， hMSH2)、mutS homolog 6 (homosapiens，hMSH6)、mutS homolog 3 (homosapiens，hMSH3)、postmeiotic segregation increased 1 (homosapiens，hPMS1)等。MMR途徑出現在DNA復制過程中，能特異性識別、切除并修復錯配堿基，以保證遺傳物質的穩定性和完整性。MMR系統中基因失活引起替莫唑胺耐藥，可能是因為細胞變得能夠耐受胸腺嘧啶與O6-甲基鳥嘌呤的錯配。在DNA復制的過程中，DNA聚合酶使O6-甲基鳥嘌呤與胸腺嘧啶錯配，從而觸發MMR依賴清除錯配的胸腺嘧啶。然而，O6-甲基鳥嘌呤依然存在，隨后O6-甲基鳥嘌呤與另外一個胸腺嘧啶錯配導致反復的MMR途徑的循環。有人認為，這是MMR系統徒勞的循環誘導雙鏈斷裂，激活凋亡途徑，誘導細胞調亡。因此，MMR缺乏的腫瘤對烷化劑如替莫唑胺的細胞毒性作用相對耐藥。同時，MMR基因失活將會引起DNA復制錯誤(RER)和微衛星不穩定性(MsI)，使整個基因組的不穩定性增加，從而導致癌相關基因突變不能及時有效糾正，使腫瘤易感。Cahill等[5]在體外研究中發現經同步放化療以及單純替莫唑胺化療復發的膠質瘤中都有hMSH6的缺失。 1.3BER途徑烷化劑耐藥的另一種重要機制是BER途徑，包括N7-甲基鳥嘌呤和N3-甲基腺嘌呤 DNA復合物的修復。該DNA復合物是由替莫唑胺作用而產生。多聚ADP-核糖聚合酶(PARP-1)在BER途徑中起著關鍵作用。這種酶被DNA鏈斷裂激活，并在大多數人類細胞系中高水平表達，這促使將PARP抑制劑作為增強替莫唑胺的細胞毒性的方法進行了研究。抑制BER途徑期盼將增加N7甲基鳥嘌呤和N3甲基腺嘌呤損傷的細胞毒性(在正常細胞和具有完整的BER途徑的腫瘤細胞很容易修復)，特別是PARP抑制劑預計將大幅提高替莫唑胺在MMR缺陷細胞中的細胞毒性，使得細胞耐受O6-甲基鳥嘌呤DNA復合物[6]。 1.4細胞凋亡調節基因除了包括DNA修復在內的上述耐藥機制，腦膠質瘤的耐藥可能受到細胞凋亡調節基因和蛋白質調節異常的影響。例如，失去p53的正常功能， Bcl-2或Bcl-XL的上調，或者表皮生長因子受體(EGFR)的過度表達等，可能會破壞DNA損傷的正常凋亡反應。眾所周知， p53基因在保護DNA損傷方面和調節間接凋亡的信號途徑上起核心作用。Trp53(在小鼠中編碼p53基因)缺陷的小鼠腫瘤和Trp53突變的細胞系對伽馬刀或化療不太敏感。通過腺病毒載體重新引入野生型Trp53的小鼠腫瘤能夠恢復對藥物毒性的敏感性，在裸鼠體內引起凋亡和抑制腫瘤生長。野生型p53與包括EGFR、 MDM2和Bcl-2在內的多種基因的啟動子相互作用，其增加了EGFR和MDM2基因的轉錄活性，抑制了Bcl-2的轉錄。在Sarkaria等[7]對于患者腫瘤組織樣本的分析中，p53的失活發生在>50%的原發神經膠質母細胞瘤，這與Bcl-2的上調相關。與這些研究結果一致，在體外神經膠質瘤細胞系中，Bcl-2或EGFR表達的上調與耐藥和降低凋亡反應有關。 EGFR是在惡性膠質瘤中最頻繁擴增和突變的癌基因，一些臨床及病理組織學的研究表明，EGFR的擴增可能影響惡性膠質瘤的化療療效。在野生型p53基因表達的人膠質瘤的一項研究中，EGFR的腫瘤源性的突變形式稱作變異Ⅲ(EGFRv Ⅲ)，其過度表達導致對順鉑耐藥，但這種突變尚不能確定對烷化劑特異性耐藥。 雖然在膠質母細胞瘤中EGFR、MDM2和Bcl-2表達的失調經常會發生，但無論是對于膠質瘤的生物學行為還是患者的生存，基因表達中這些變化現在還沒有一個可明確作為獨立的預測因素。為了克服多形性膠質瘤表型的耐藥，更多研究針對細胞調節凋亡機制和DNA損傷的敏感性。烷化劑替莫唑胺的活性可能與MGMT的活性密切相關。一項研究揭示了人惡性膠質瘤細胞系中MGMT、Bcl-XL及p53對調節烷化劑細胞毒性的作用。這項研究表明， Bcl-XL蛋白在MGMT陰性的LNT229細胞中減弱替莫唑胺的毒性作用，但在MGMT陽性LN-18細胞中沒有減弱替莫唑胺的毒性作用。野生型p53功能的喪失、RNA干擾或一種顯性失活p53的突變體同樣賦予替莫唑胺耐藥。相反，穩定的p53野生型構象如cp-31398使膠質瘤對替莫唑胺敏感[8]。此外，由于低級別膠質瘤中p53突變發生率高，他們可能對替莫唑胺不太敏感。然而，這些結論受臨床前應用模式限制，可能不能準確反映臨床表現。 2臨床前期模型實驗對克服耐藥的作用 理想情況下，臨床前期模型實驗將有利于獲得最佳治療方案，從而使最有效的治療方案進入臨床試驗。這些模型系統可作為治療反應的預測指標，指導新治療因子及治療方法，從而最大限度地減少患者接受無效的治療方法。其中的動物模型在研究腫瘤發病機制、模擬腫瘤發生過程、測試腫瘤治療方法中起重要的作用[9-10]。 2.1細胞培養模型目前有幾種細胞培養模型已用來檢測MGMT在替莫唑胺耐藥方面的作用。例如，缺乏內源性MGMT表達的中國倉鼠卵巢細胞研究表明，MGMT的過度表達導致替莫唑胺耐藥[11]。同樣，建立膠質瘤細胞系為研究MGMT水平與膠質瘤對各種烷化劑的敏感性的相互關系提供了模型。雖然細胞培養模型對腫瘤治療的作用寶貴，但這些模型并不能準確預測到臨床上烷化劑細胞毒性作用或生物制劑對腫瘤細胞的反應。培養的細胞系，不一定準確反映原發腫瘤的生物學特征或異質性及其對治療的反應。 2.2轉基因小鼠模型轉基因小鼠模型是通過轉基因方法建立的動物模型，模型可以用作測試針對特別影響途徑的治療方案。例如，轉基因小鼠被設計成能夠涵蓋多形性膠質母細胞瘤的關鍵遺傳學特征(如EGFR突變)的模型，這類小鼠適合評價特別分子機制對治療的影響。最近發現的條件性SV40 TAg轉基因小鼠模型，可為不同生長期腦腫瘤發生過程的研究以及治療措施的評價提供幫助，是一種重要的實驗動物模型[12]。 2.3異種移植模型異種移植模型建立的細胞系往往發展成為皮下(異位)和頭顱內(常位)的腫瘤。但是，利用已建立的膠質瘤細胞系進行原位移植，一般不能重建人類原發膠質母細胞瘤浸潤性生長模式，相反，它們容易在注射部位形成實質性病變，壓縮，而不是入侵實質細胞。此外，腫瘤細胞在培養基中的生長可能導致高度選擇，造成重要的基因突變的丟失，這些基因突變原來普遍存在于原發性膠質母細胞瘤中，常見的如EGFR基因擴增[13]。雖然使用細胞異位移植對研究腫瘤生物學特征提供了一些幫助，但它最大的缺點是腫瘤發生是人為造成的(異種植入)，且生長于免疫抑制環境中(裸鼠)，缺乏腫瘤細胞與周圍環境的相互作用，相對人類膠質瘤的發生發展仍存在較大差異。最近，一種可連續移植的裸鼠異種移植瘤模型被發現，這對于研究腫瘤的發生、發展過程，正確評價各種治療方案和揭示生物學和臨床關于耐藥的機制等具有重要意義[14-15]。在這個模型下，膠質母細胞瘤組織樣本從患者身上獲得，并連續在無胸腺裸鼠的側腹部增殖。這種傳播方式允許保存其主要形態學和組織病理學的特征，如存在壞死，類似原發的膠質母細胞瘤的壞死。 3PARP抑制劑 PARP屬于非組蛋白染色體蛋白質，目前已經被發現的家族成員有PARP-1、PARP-2、PARP-3、tankyrase-1、tankyrase-2、sPARP、vPARP等[16]。在生理情況下，PARP的功能是通過BER途徑幫助修復單鏈DNA破裂，維持基因組的穩定。 在腫瘤治療領域，臨床前期模型研究表明，PARP-1抑制劑可以加強放療和化療藥物的作用[17-22]，同時PARP-1抑制劑也表明單因子的作用能夠抑制某些腫瘤細胞系[23-24]。AG-1436是PARP-1的一個強效抑制劑，在研究AG-14361對替莫唑胺細胞毒性的影響上，通過對2種遺傳上匹配的基因進行研究：原代細胞系是MMR缺失，配對細胞系通過3號染色體的轉讓是MMR表達。結果，在MMR表達和MMR缺失的細胞系上，AG-14361都增加替莫唑胺的細胞毒性，但在MMR缺失細胞系上增幅更大(在MMR缺失細胞株中為3.7~5.2倍的增幅和MMR表達中為1.5~3.3倍的增幅比)。因為正常組織(特別是造血系統)中MMR表達，而腫瘤細胞可能是MMR缺失，所以在臨床環境使用PARP抑制劑去增強烷化劑如替莫唑胺等的活性更能增強對腫瘤細胞的毒性作用。雖然PARP抑制劑提高了烷化劑藥物對腫瘤細胞的毒性，但其可能會使烷化劑對正常組織的毒性顯著增加。

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