作者：韓英時永全鄭悅張宏博樊代明

【關鍵詞】 蛋白激酶

關鍵詞: 蛋白激酶C;同工酶;胃癌;多藥耐藥

摘 要:目的 觀察傳統型蛋白激酶C（cPKCs）在胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR1.0、耐藥亞系SGC7901/VCR0.3，SGC7901/VCR0.7及藥敏細胞系SGC7901表達及活性的變化，以及對細胞內藥物濃度的影響. 方法 用免疫熒光化學及蛋白印跡方法觀察傳統型蛋白激酶C在胃癌耐藥細胞系及藥敏細胞系的表達;競爭蛋白結合法測定PKC的活性;應用流式細胞儀觀察細胞內藥物濃度的變化. 結果 PKCα，PKCβⅠ ，PKCβ Ⅱ 及PKCγ在胃癌耐藥細胞系及藥敏細胞系均有表達，PKCα在耐藥細胞表達呈強陽性，在藥敏細胞表達呈陽性;PKCβⅠ 及PKCβⅡ 在耐藥細胞及藥敏細胞表達均為陽性;PKCγ在耐藥細胞及藥敏細胞表達均為強陽性.免疫蛋白印跡實驗證實，隨耐藥指數的增加，PKCα表達呈逐漸增高的趨勢，薄層掃描蛋白印跡帶的吸光度（A）分別為9584.17，9421.06，8534.64，8088.79，而PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐藥細胞系、耐藥亞系及其藥敏細胞系表達無明顯變化.PKC活性檢測結果提示，隨耐藥指數的增加，PKC活性呈逐漸增高的趨勢，以細胞質及細胞核的PKC活性增高為主. 結論 傳統型蛋白激酶C在維持胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR的多藥耐藥中起重要作用且具有同工酶特異性.

Keywords:protein kinase C;isoenzyme;gastric cancer;mul-tidrug resistance

Abstract:AIM To observe the expression and activity of classic protein kinase C in gastric cancer cell SGC7901and its drug-resistant sublines SGC7901/VCR slected by vincristine of different concentration（0.3，0.7and1.0μg?mL-1 ）.To explore the effect of classic protein kinase C on drug concen-tration within gastric cancer cells.METHODS The expres-sion of classic protein kinase C in gastric cancer cells was de-termined by immuno-fluorescent method and Western blot.The PKC activity was determined by competed protein bind-ing method.The drug concentration within cells was deter-mined by FACS.RESULTS Both SGC7901and SGC7901/VCR cells exhibited positive staining of PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ and PKCγ.The staining of PKCαin SGC7901/VCR was much stronger than that in SGC7901.There were no dif-ferences in the expression of PKCβⅠ ，PKCβⅡ and PKCγbe-tween SGC7901and SGC7901/VCR.By using Western blot，continuous increasing expression of PKCαin SGC7901/VCR was demonstrated along with the increasing resistant index，as well as no differences between SGC7901and its drug-resis-tant sublines.Results of activity assay showed continuous in-creasing activity of PKC in gastric cancer cells along with in-creasing resistant index.CONCLUSION Classic protein ki-nase C plays an important role in multidrug resistance of gas-tric cancer cells with isoenzyme specificity.

0 引言

蛋白激酶C是一類廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前發現至少有12種同工酶亞型.按其生化性質及結構可分為四大類.由鈣、磷酯（PL）、二酰基甘油（DAG）或佛波酯激活的PKC為傳統型（cPKCs）;不依賴鈣而由PL，DAG或佛波酯活化的PKC類為新型（nPKCs）;僅由PL類物激活的為非典型型（aPKCs）;PKCμ不需鈣、DAG激活，而由磷酯酰肌醇-4，5二磷酸激活，但在結構上與前三種部分類似，故稱為第四種PKC［1，2］ .PKC具有異質性，不同的PKC亞類位于不同類型的細胞以及同一細胞內的不同部位，因而表現出不同的功能.近期研究提示，cPKCs可能參與了多藥耐藥的形成且具有同工酶特異性.本研究擬觀察cPKCs在胃癌耐藥細胞系、耐藥亞系和藥敏細胞系的表達及活性的變化以及對細胞內藥物濃度的影響，以進一步揭示信號轉導分子PKC在多藥耐藥發生中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 SGC7901細胞系由軍事醫學科學院惠贈，耐藥細胞系SGC7901/VCR1.0及其耐藥亞系SGC7901/VCR0.3，SGC7901/VCR0.7由本室誘導.兔抗人PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司;羊抗兔IgG-FITC購自中山公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自武漢博士德公司;PKC活性分析試劑盒購自Gibcobrl公司;［γ-32 P］ATP購自北京亞輝公司.細胞生長于含100mL?L-1 已滅活小牛血清的RP-MI1640培養液中，37℃，50mL?L-1 CO2 的條件下培養，耐藥細胞培養液中分別加入0.3，0.7和1mg?L-1 長春新堿以維持耐藥表型，用于實驗前耐藥細胞在不加長春新堿的培養液中培養2wk.

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光化學 取對數生長期的耐藥細胞SGC7901/VCR及藥敏細胞SGC7901，用2.5g?L-1 的胰酶消化傳代于裝有載玻片的培養皿中，培養24h后，用PBS沖洗3次，冷丙酮固定［3，4］ .PBS洗3次，加50mL?L-1 H2 O2 室溫15min，水洗3次;3mL?L-1 Triton X-100室溫15min，吸去不洗;1∶10的血清封閉30min，吸去不洗;分別加兔抗人多克隆抗體PKCα（2mg?L-1 ），PKCβⅠ （2mg?L-1 ），PKCβⅡ （4mg?L-1 ）及PKCγ（4mg?L-1 ），37℃孵育1h，PBS洗3次;加羊抗兔IgG-FITC（1∶60），37℃孵育1h，PBS洗3次，用500mL?L-1 的緩沖甘油封片.實驗同時設PBS或無關抗體為替代一抗的陰性對照.

1.2.2 Western blot 收獲對數生長期的細胞并用冷PBS清洗2次，以裂解緩沖液［50mmol?L-1 Tris-Cl（pH7.5），150mmol?L-1 NaCl，0.2mmol?L-1 EDTA，1mmol?L-1 PMSF和10g?L-1 NP-40］裂解細胞制備細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度;取150μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，通過電轉移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移至硝酸纖維素濾膜上，麗春紅S染色并標記蛋白分子質量標準;去離子水漂去麗春紅后以50g?L-1 脫脂奶粉于室溫1h封閉濾膜，常規分別結合兔抗人PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ多克隆抗體、辣根過氧化物 酶標記的羊抗兔IgG，最后以DAB顯色目的條帶.

1.2.3 PKC活性檢測 參照文獻［5］并進行改良取對數生長期的耐藥細胞系、耐藥亞系及藥敏細胞系，用2.5g?L-1 的胰酶消化傳代于10cm的培養皿中，至對數生長期，冷PBS沖洗2次后，用細胞刮收取細胞，加Buffer A1mL（Tris/EGTA/EDTA，β-巰基乙醇、蛋白酶抑制劑），用超聲粉碎機粉碎，每次20s，共3次，然后1000g離心15min，沉淀部分超聲粉碎后12000g離心10min，所得上清為細胞核部分;上清100000g4℃離心1h，所得上清為細胞質PKC部分;所得沉淀部分加含10mL?L-1 Triton X-100的BufferA抽提細胞膜PKC30min，每10min震蕩1次，然后進行超聲粉碎.蛋白定量用Bradford法，活性檢測步驟按試劑盒要求進行，所測活性為cPKCs的總活性，PKC比活性用nmol?g-1 ?min-1 表示.

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞內藥物濃度 參照文獻［6，7］進行.取對數生長期細胞用2.5g?L-1 胰酶消化成單細胞懸液，接種6孔板并繼續培養48h.加阿霉素至終濃度為5mg?L-1 ，繼續培養1h，冷PBS洗3次，用細胞刮收獲細胞離心，再以冷PBS重新懸浮，保存于4℃，上流式細胞儀檢測.激發波長為488nm，接收波長為575nm.

統計學處理:用方差分析.

2 結果

2.1 免疫熒光化學 PKCα在耐藥細胞系SGC7901/VCR表達呈強陽性，在藥敏細胞系SGC-7901表達呈陽性;PKCβⅠ 及PKCβⅡ 在耐藥細胞及藥敏細胞表達均呈陽性;PKCγ在耐藥細胞及藥敏細胞表達均呈強陽性.

2.2 Western blotting PKCα在耐藥細胞系及耐藥亞系較其藥敏細胞系表達明顯增加，隨耐藥指數的增加PKCα表達呈逐漸增加的趨勢，薄層掃描蛋白印跡帶的吸光度（A）分別為9584.17，9421.06，8534.64和8088.79（Fig1）.PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐藥細胞及藥敏細胞無明顯差異（Fig1）.

2.3 PKC活性檢測結果 胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR及其耐藥亞系與其藥敏細胞比PKC活性明顯增高，其中以細胞質及細胞核PKC活性增高比較明顯（Tab1）.

2.4 細胞內藥物濃度 胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR及其耐藥亞系與其藥敏細胞系比細胞內藥物濃度明顯減低，且具有統計學意義（P<0.01），隨耐藥指數的增加細胞內阿霉素的濃度呈逐漸減低的趨勢. 圖1 略

表1 胃癌耐藥細胞系及其藥敏細胞PKC活性略

3 討論

傳統型蛋白激酶C，即鈣、磷酯依賴的蛋白激酶C，包括4種同工酶亞型PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ，Mr 80000～90000.cPKCs亞型分布有明顯的組織特異性，如胰腺表達PKCα，PKCβⅡ ，而無PKCβⅠ 及PKCγ的表達;腎上腺皮質和髓質細胞表達PKCα，而間質細胞表達PKCβⅠ 和PKCγ;人白血病細胞表達PKCα，PKCβ和PKCγ.不同PKC亞型選擇性器官分布提示它們在功能上的差異，多種亞型可在同一組織甚至同一細胞中存在，并介導不同的信號傳遞功能.我們觀察了cPKCs在胃癌耐藥細胞系及其藥敏細胞系的表達［8］ ，PKCα在耐藥細胞表達呈強陽性，在藥敏細胞表達呈陽性;PKCβⅠ ，PKCβⅡ 在耐藥細胞及藥敏細胞表達均呈陽性;PKCγ在耐藥細胞及藥敏細胞表達均呈強陽性.蛋白印跡實驗證實，隨耐藥指數的增加，PKCα的表達呈逐漸增高的趨勢，而PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐藥細胞及藥敏細 胞的表達無明顯差異.提示PKCα在維持胃癌細胞的耐藥表型中可能起重要作用.

有研究表明，在體外建立的耐藥細胞株，較相應的敏感株蛋白激酶C活性明顯增高［9］ .近年來也有研究表明耐藥細胞系PKC的表達及活性較其藥敏細胞系減低，但有趣的是這些細胞的基礎PKC表達及活性水平與細胞耐藥后PKC活性增高的細胞比高出許多倍，提示如果PKC活性的基礎水平比較高，MDR表達不一定伴有PKC活性的增高［10］ .上述事實說明，腫瘤細胞獲得MDR后，PKC活性的改變可能取決于親代細胞本身的特性以及所誘導的藥物類型.我們檢測了胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR1.0，SGC7901/VCR0.7及SGC7901/VCR0.3及其藥敏細胞SGC7901的PKC活性，提示細胞耐藥后PKC總活性、細胞質及細胞核的活性明顯增高，隨耐藥指數的增加呈逐漸增高的趨勢，細胞膜的PKC活性無明顯改變.可能是因為化療藥物長期誘導耐藥細胞導致PKC的表達增加，而PKC通常以無活性的形式存在于細胞質，無化療藥物及其他刺激時細胞質內的PKC含量較多，所以檢測到的結果細胞耐藥后細胞質內PKC的活性較高而細胞膜的活性無明顯變化，細胞核內PKC活性的增高可能與維持MDR表型蛋白的基因轉錄與表達有關.

MDR經常與PKC的水平和活性有關.從我們的實驗結果也可以看出，PKC活性水平的升高與PKCα的表達有明顯的相關性，隨耐藥指數的增加PKC的活性及PKCα的表達呈逐漸增高的趨勢，細胞內藥物濃度呈逐漸減低的趨勢，更進一步說明PKCα在維持胃癌細胞的耐藥表型中起重要作用.無論如何，對于PKC不同同工酶亞型與胃癌多藥耐藥性相關性的研究，為進一步明確胃癌的多藥耐藥機制以及選擇逆轉耐藥的藥物將會提供有益的幫助.

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