【摘要】 目的：研究雙鏈短干擾RNA（siRNA）對白血病多藥耐藥細胞模型（K562/NaB）肺耐藥相關蛋白（LRP）表達及功能的影響. 方法： 針對LRP基因設計合成特異性siRNA，在脂質體介導下轉染K562/NaB；采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測K562細胞LRP mRNA的水平；用流式細胞術檢測K562/NaB細胞LRP蛋白表達的變化和細胞內柔紅霉素（DNR）的蓄積；MTT法檢測阿霉素（ADM）對K562/NaB細胞耐藥的半數抑制濃度（IC50）. 結果： siRNA轉染后：K562/NaB細胞的LRP mRMA水平明顯降低；LRP蛋白表達由陽性轉為陰性；細胞內DNR的蓄積明顯增加，DNR平均熒光增強3.28倍；對ADM藥物敏感相對逆轉效率為78.18%. 結論： siRNA可逆轉由LRP介導的白血病細胞多藥耐藥. 【關鍵詞】 RNA，小分子干擾；基因，肺耐藥相關蛋白；K562細胞；抗藥性，多藥 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of short interfering RNA (siRNA) on expression and function of lung resistancerelated protein (LRP) in the multidrug resistant human leukemia cells (K562/NaB). METHODS: Multidrugresistant K562 cells with high level LRP expression treated with sodium butyrate (NaB)， was used as an in vitro model system. LRP specific siRNA was synthesized and transfected into the K562/NaB cells. Expression of LRP mRNA was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR)， and protein level and intracellular daunorubicin (DNR) accumulation in K562/NaB cells were detected by flow cytometry. 50% inhibition concentration (IC50) of adriamycin (ADM) on K562/NaB cells was detected by MTT method. RESULTS: LRP mRNA level was decreased obviously; the protein expression was turned from positive result to negative result. Intracellular DNR accumulation was increased and the mean fluorescence of DNR was 3.28 times higher. The relative efficiency to ADM was 78.18％. CONCLUSION: The siRNA could effectively reverse the multidrug resistance of leukemia cells induced by LRP. 【Keywords】RNA， small interfering; gene， lung resistancerelated protein; K562 cells; drug resistance， multiple 0引言 肺耐藥相關蛋白（lungrelated resistant protein， LRP）是一種新型的與多藥耐藥（multidrug resistance， MDR）相關的糖蛋白，主要導致細胞內藥物聚集缺陷，而在多種腫瘤細胞內引起MDR. 在兒童白血病以及成人髓系白血病（AML）中，LRP表達是獨立的預后決定因素之一，其過度表達造成患者對化療不敏感，提示預后不良［1-2］. 雙鏈短干擾RNA（short interfering RNA， siRNA）介導的RNA干擾（RNA interference， RNAi），是在特異性抑制哺乳動物細胞基因方面的最新突破［3-4］. 我們在建立了經丁酸鈉（sodium butyrate， NaB）誘導人AML系 K562細胞，高表達LRP并介導多藥耐藥的細胞模型（K562/NaB）的基礎上［5］，設計合成了LRP特異性siRNALRP，并轉染上述細胞模型，觀察siRNALRP抑制LRP基因和蛋白表達、消除LRP改變細胞內藥物蓄積和分布作用的效果，以期為逆轉LRP介導的腫瘤細胞MDR、提高兒童難治性和復發性白血病化療效果探索新的方法，并探討以siRNA介導的RNAi用于腫瘤細胞MDR治療的可行性. 1材料和方法 1.1材料 AML細胞系K562細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所；單克隆抗體LRP56為Monosan公司產品；固定和破膜試劑盒、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光標記羊抗鼠IgG抗體為Caltolog Laboratories產品；NaB為Sigma公司產品. LRP特異性短干涉RNA(siRNALRP)自行設計，由Dharmacon公司合成. 濃度20 μmmol/L，序列：5′ GCU CUU UUC AGU GCC AGA C dTdT （正義鏈），dTdT CGA GAA AAG UCA CGG UCU G 5′ （反義鏈）. 1.2方法 1.2.1K562細胞培養和高表達 LRP的K562多藥耐藥細胞模型（K562/N）［10］K562細胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培養基于37℃， 50 ml/L CO2條件下培養. K562細胞在含2 mmol/L NaB的培養液中處理3 d，制作K562細胞高表達LRP的多藥耐藥細胞模型，命名為K562/NaB. 陰性對照組不加NaB. 1.2.2siRNA轉染 實驗K562/NaBsiRNA組：取K562/NaB細胞接種于24孔板內，每孔500 μL，濃度為3×108/ L. 分別以無血清RPMI 1640培養液 50 μL稀釋siRNALRP， Lipofectamine各1 μL，混勻靜置后加入細胞懸液. 再加入NaB使終濃度為2 mmol/L，進行細胞培養. 每24 h以含2 mmol/L NaB的RPMI 1640培養基500 μL換液，連續3 d. 轉染后24， 48， 72 h分別取細胞進行相關檢測. K562/NaBH2O組：取K562/NaB細胞，以無RNase水代替siRNALRP轉染細胞，操作方法、實驗條件同siRNA轉染組. 取轉染72 h細胞進行檢測. 對照組： K562/NaB細胞作為陽性對照；原始的K562細胞作為陰性對照. 1.2.3RTPCR方法檢測 K562細胞LRP mRNA水平同時取實驗和對照組細胞各1×106，以Trizol提取總RNA，以RTPCR檢測LRP mRNA水平. 反轉錄以Oligo(dt)15作為引物，37℃ 1 h. PCR引物：LRP上游引物：5′GAT CCG ACC AGT CAG AAG CCG AG3′，下游引物：5′AAT TCA CTT CTT CAC CTC CAC CTC AGC C3′，擴增產物300 bp. 內對照GAPDH上游引物：5′AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA3′，下游引物：5′CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3′，擴增產物590 bp. 擴增條件：95℃ 1 min，然后按94℃ 40 s， 58℃ 45 s， 70℃ 45 s，循環 30次，最后以72℃ 10 min結束反應. RTPCR產物電泳，LRP條帶和GAPDH條帶吸收峰比值LRP/GAPDH>0.3，視為LRP mRNA表達陽性. 1.2.4流式細胞術檢測 K562細胞LRP蛋白表達以LRP的單克隆抗體LRP56為一抗，PE標記的羊抗鼠IgG為二抗，標記各組K562細胞，在流式細胞儀上檢測其LRP蛋白的表達情況. 同時取實驗和對照組的細胞各1×106，依次加入前固定液、打孔劑和LRP56單抗混合物、PE標記羊抗鼠IgG，避光保存. 各步驟間以含1 ml/L 疊氮鈉、100 ml/L 小牛血清的PBS 洗滌細胞2次. 標記4 h內上流式細胞儀檢測LRP蛋白表達，LRP陽性細胞>5%視為陽性結果. 1.2.5流式細胞術檢測 細胞內柔紅霉素（daunorubicin， DNR）蓄積同時取K562/NaBsiRNA組轉染72 h的細胞、K562/NaBH2O組和陽性對照、陰性對照細胞各2×106，在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養基中調整細胞濃度為1×109/L，加入DNR使終濃度為1 μmol/L，于37℃， 50 mL/L CO2，飽和濕度條件下培養2 h. 洗滌后立即以流式細胞儀FL 2通道在相同條件下隨機檢測10 000個細胞. 以不加DNR的K562細胞作為空白對照. 1.2.6MTT法檢測 ADM的IC50同時取K562/NaBsiRNA組轉染72 h的細胞、K562/NaBH2O組和陽性對照、陰性對照細胞，調整細胞濃度至1×108/L，在96孔板的各孔中加入180 μL細胞和不同濃度（0.1 μg ~100.0 μg）的ADM，培養72 h后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，繼續孵育4 h，570 nm波長處測定吸光度（A）值. 按以下公式分別計算相對逆轉效率. 相對逆轉效率=（IC50A- IC50B）/（IC50A-IC50C）. 其中IC50A是K562/NaB細胞的IC50，IC50B是轉染siRNA的K562/NaB細胞的IC50，IC50C是K562細胞的IC50. 統計學處理：采用χ2檢驗和OneWay ANOVA檢驗. P<0.05認為具有統計學意義. 2結果 2.1K562/NaB細胞LRP mRNA水平的變化 K562/NaBH2O組、陰性對照、陽性對照LRP mRNA表達陽性，其中陰性對照LRP/GAPDH 0.53，H2O轉染組、陽性對照LRP/GAPDH分別為0.96， 0.98，較陰性對照明顯升高. K562/NaBsiRNA組中，轉染24， 48， 72 h， LRP mRNA檢測均為陰性，較K562/NaBH2O組、陽性對照、陰性對照明顯減低（圖1）. 2.2K562/NaB細胞LRP蛋白表達的變化 K562/NaBsiRNA組轉染48 h和72 h的細胞、陰性對照細胞LRP表達陰性；K562/NaBsiRNA組轉染24 h的細胞、H2O轉染組、陽性對照LRP表達陽性. 當陰性對照LRP陽性率為1.77%時，K562/NaBH2O組、陽性對照LRP陽性表達率分別為36.11%和35.10%，后二者LRP表達無明顯差異（P>0.05）；K562/NaBsiRNA組中，轉染24 h， 48 h， 72 h后，LRP陽性率分別為14.98%， 1.39%和1.55%，轉染24 h后LRP表達較K562/NaB H2O組、陽性對照明顯減少（P<0.01）；轉染48， 72 h后， LRP陽性表達較轉染24 h明顯減少（P<0.01）.

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