【摘要】 目的：研究雙鏈短干擾RNA（siRNA）對白血病多藥耐藥細(xì)胞模型（K562/NaB）肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）表達(dá)及功能的影響. 方法： 針對LRP基因設(shè)計合成特異性siRNA，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染K562/NaB；采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測K562細(xì)胞LRP mRNA的水平；用流式細(xì)胞術(shù)檢測K562/NaB細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)的變化和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素（DNR）的蓄積；MTT法檢測阿霉素（ADM）對K562/NaB細(xì)胞耐藥的半數(shù)抑制濃度（IC50）. 結(jié)果： siRNA轉(zhuǎn)染后：K562/NaB細(xì)胞的LRP mRMA水平明顯降低；LRP蛋白表達(dá)由陽性轉(zhuǎn)為陰性；細(xì)胞內(nèi)DNR的蓄積明顯增加，DNR平均熒光增強(qiáng)3.28倍；對ADM藥物敏感相對逆轉(zhuǎn)效率為78.18%. 結(jié)論： siRNA可逆轉(zhuǎn)由LRP介導(dǎo)的白血病細(xì)胞多藥耐藥. 【關(guān)鍵詞】 RNA，小分子干擾；基因，肺耐藥相關(guān)蛋白；K562細(xì)胞；抗藥性，多藥 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of short interfering RNA (siRNA) on expression and function of lung resistancerelated protein (LRP) in the multidrug resistant human leukemia cells (K562/NaB). METHODS: Multidrugresistant K562 cells with high level LRP expression treated with sodium butyrate (NaB)， was used as an in vitro model system. LRP specific siRNA was synthesized and transfected into the K562/NaB cells. Expression of LRP mRNA was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR)， and protein level and intracellular daunorubicin (DNR) accumulation in K562/NaB cells were detected by flow cytometry. 50% inhibition concentration (IC50) of adriamycin (ADM) on K562/NaB cells was detected by MTT method. RESULTS: LRP mRNA level was decreased obviously; the protein expression was turned from positive result to negative result. Intracellular DNR accumulation was increased and the mean fluorescence of DNR was 3.28 times higher. The relative efficiency to ADM was 78.18％. CONCLUSION: The siRNA could effectively reverse the multidrug resistance of leukemia cells induced by LRP. 【Keywords】RNA， small interfering; gene， lung resistancerelated protein; K562 cells; drug resistance， multiple 0引言 肺耐藥相關(guān)蛋白（lungrelated resistant protein， LRP）是一種新型的與多藥耐藥（multidrug resistance， MDR）相關(guān)的糖蛋白，主要導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物聚集缺陷，而在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)引起MDR. 在兒童白血病以及成人髓系白血病（AML）中，LRP表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后決定因素之一，其過度表達(dá)造成患者對化療不敏感，提示預(yù)后不良［1-2］. 雙鏈短干擾RNA（short interfering RNA， siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾（RNA interference， RNAi），是在特異性抑制哺乳動物細(xì)胞基因方面的最新突破［3-4］. 我們在建立了經(jīng)丁酸鈉（sodium butyrate， NaB）誘導(dǎo)人AML系 K562細(xì)胞，高表達(dá)LRP并介導(dǎo)多藥耐藥的細(xì)胞模型（K562/NaB）的基礎(chǔ)上［5］，設(shè)計合成了LRP特異性siRNALRP，并轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞模型，觀察siRNALRP抑制LRP基因和蛋白表達(dá)、消除LRP改變細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積和分布作用的效果，以期為逆轉(zhuǎn)LRP介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞MDR、提高兒童難治性和復(fù)發(fā)性白血病化療效果探索新的方法，并探討以siRNA介導(dǎo)的RNAi用于腫瘤細(xì)胞MDR治療的可行性. 1材料和方法 1.1材料 AML細(xì)胞系K562細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；單克隆抗體LRP56為Monosan公司產(chǎn)品；固定和破膜試劑盒、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體為Caltolog Laboratories產(chǎn)品；NaB為Sigma公司產(chǎn)品. LRP特異性短干涉RNA(siRNALRP)自行設(shè)計，由Dharmacon公司合成. 濃度20 μmmol/L，序列：5′ GCU CUU UUC AGU GCC AGA C dTdT （正義鏈），dTdT CGA GAA AAG UCA CGG UCU G 5′ （反義鏈）. 1.2方法 1.2.1K562細(xì)胞培養(yǎng)和高表達(dá) LRP的K562多藥耐藥細(xì)胞模型（K562/N）［10］K562細(xì)胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃， 50 ml/L CO2條件下培養(yǎng). K562細(xì)胞在含2 mmol/L NaB的培養(yǎng)液中處理3 d，制作K562細(xì)胞高表達(dá)LRP的多藥耐藥細(xì)胞模型，命名為K562/NaB. 陰性對照組不加NaB. 1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)K562/NaBsiRNA組：取K562/NaB細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，每孔500 μL，濃度為3×108/ L. 分別以無血清RPMI 1640培養(yǎng)液 50 μL稀釋siRNALRP， Lipofectamine各1 μL，混勻靜置后加入細(xì)胞懸液. 再加入NaB使終濃度為2 mmol/L，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng). 每24 h以含2 mmol/L NaB的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL換液，連續(xù)3 d. 轉(zhuǎn)染后24， 48， 72 h分別取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測. K562/NaBH2O組：取K562/NaB細(xì)胞，以無RNase水代替siRNALRP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作方法、實(shí)驗(yàn)條件同siRNA轉(zhuǎn)染組. 取轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞進(jìn)行檢測. 對照組： K562/NaB細(xì)胞作為陽性對照；原始的K562細(xì)胞作為陰性對照. 1.2.3RTPCR方法檢測 K562細(xì)胞LRP mRNA水平同時取實(shí)驗(yàn)和對照組細(xì)胞各1×106，以Trizol提取總RNA，以RTPCR檢測LRP mRNA水平. 反轉(zhuǎn)錄以O(shè)ligo(dt)15作為引物，37℃ 1 h. PCR引物：LRP上游引物：5′GAT CCG ACC AGT CAG AAG CCG AG3′，下游引物：5′AAT TCA CTT CTT CAC CTC CAC CTC AGC C3′，擴(kuò)增產(chǎn)物300 bp. 內(nèi)對照GAPDH上游引物：5′AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA3′，下游引物：5′CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3′，擴(kuò)增產(chǎn)物590 bp. 擴(kuò)增條件：95℃ 1 min，然后按94℃ 40 s， 58℃ 45 s， 70℃ 45 s，循環(huán) 30次，最后以72℃ 10 min結(jié)束反應(yīng). RTPCR產(chǎn)物電泳，LRP條帶和GAPDH條帶吸收峰比值LRP/GAPDH>0.3，視為LRP mRNA表達(dá)陽性. 1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測 K562細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)以LRP的單克隆抗體LRP56為一抗，PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，標(biāo)記各組K562細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測其LRP蛋白的表達(dá)情況. 同時取實(shí)驗(yàn)和對照組的細(xì)胞各1×106，依次加入前固定液、打孔劑和LRP56單抗混合物、PE標(biāo)記羊抗鼠IgG，避光保存. 各步驟間以含1 ml/L 疊氮鈉、100 ml/L 小牛血清的PBS 洗滌細(xì)胞2次. 標(biāo)記4 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測LRP蛋白表達(dá)，LRP陽性細(xì)胞>5%視為陽性結(jié)果. 1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測 細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素（daunorubicin， DNR）蓄積同時取K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞、K562/NaBH2O組和陽性對照、陰性對照細(xì)胞各2×106，在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，加入DNR使終濃度為1 μmol/L，于37℃， 50 mL/L CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)2 h. 洗滌后立即以流式細(xì)胞儀FL 2通道在相同條件下隨機(jī)檢測10 000個細(xì)胞. 以不加DNR的K562細(xì)胞作為空白對照. 1.2.6MTT法檢測 ADM的IC50同時取K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞、K562/NaBH2O組和陽性對照、陰性對照細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/L，在96孔板的各孔中加入180 μL細(xì)胞和不同濃度（0.1 μg ~100.0 μg）的ADM，培養(yǎng)72 h后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h，570 nm波長處測定吸光度（A）值. 按以下公式分別計算相對逆轉(zhuǎn)效率. 相對逆轉(zhuǎn)效率=（IC50A- IC50B）/（IC50A-IC50C）. 其中IC50A是K562/NaB細(xì)胞的IC50，IC50B是轉(zhuǎn)染siRNA的K562/NaB細(xì)胞的IC50，IC50C是K562細(xì)胞的IC50. 統(tǒng)計學(xué)處理：采用χ2檢驗(yàn)和OneWay ANOVA檢驗(yàn). P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1K562/NaB細(xì)胞LRP mRNA水平的變化 K562/NaBH2O組、陰性對照、陽性對照LRP mRNA表達(dá)陽性，其中陰性對照LRP/GAPDH 0.53，H2O轉(zhuǎn)染組、陽性對照LRP/GAPDH分別為0.96， 0.98，較陰性對照明顯升高. K562/NaBsiRNA組中，轉(zhuǎn)染24， 48， 72 h， LRP mRNA檢測均為陰性，較K562/NaBH2O組、陽性對照、陰性對照明顯減低（圖1）. 2.2K562/NaB細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)的變化 K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染48 h和72 h的細(xì)胞、陰性對照細(xì)胞LRP表達(dá)陰性；K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞、H2O轉(zhuǎn)染組、陽性對照LRP表達(dá)陽性. 當(dāng)陰性對照LRP陽性率為1.77%時，K562/NaBH2O組、陽性對照LRP陽性表達(dá)率分別為36.11%和35.10%，后二者LRP表達(dá)無明顯差異（P>0.05）；K562/NaBsiRNA組中，轉(zhuǎn)染24 h， 48 h， 72 h后，LRP陽性率分別為14.98%， 1.39%和1.55%，轉(zhuǎn)染24 h后LRP表達(dá)較K562/NaB H2O組、陽性對照明顯減少（P<0.01）；轉(zhuǎn)染48， 72 h后， LRP陽性表達(dá)較轉(zhuǎn)染24 h明顯減少（P<0.01）.

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