作者：秦維超 張有順 周新 胡禮儀

【摘要】 目的： 重組構建抑制多藥耐藥MDR1基因表達的shRNA真核表達載體，研究其對肝癌耐藥細胞MDR1基因表達的抑制作用，以及對P糖蛋白（Pgp）表達和功能的抑制作用. 方法： 根據MDR1基因序列，設計兩段21個堿基的MDR1特異性靶序列作為shRNA目標序列（shMDR11，shMDR12），重組構建pshMDR1表達質粒. 采用脂質體介導轉染肝癌耐藥細胞SMMC7721/R，用MTT法測定細胞對化療藥物阿霉素（ADM）的敏感性，流式細胞儀檢測細胞膜表面P糖蛋白（Pgp）表達和細胞內Rhdaming123（Rh123）的潴留. 結果： PCR和DNA測序證實了pshMDR11和pshMDR12重組質粒的成功構建，均能有效地抑制細胞Pgp表達；轉染細胞后均能夠一定程度地恢復耐藥細胞對化療藥物ADM敏感性，Pgp表達水平明顯降低，細胞內的Rh123穩態積累量均明顯增高；第1條序列更能有效的抑制MDR1基因表達. 結論： 體外完成shRNA RNAi載體的構建，能有效地逆轉肝癌耐藥細胞MDR1基因過度表達，抑制Pgp介導的多藥耐藥. 從DNA載體產生的shRNA在肝癌耐藥細胞內能誘導RNAi，能夠序列特異性地抑制MDR1基因表達. 【關鍵詞】 RNA干擾；抗藥性，多藥；短發夾RNA；重組，遺傳；質粒；基因表達 【Abstract】 AIM: To construct a recombinant plasmid generating short hairpin RNA(shRNA) containing multidrug resistance gene MDR1 segment in mammalian cells and to investigate its suppression on MDR1 mRNA and Pglycoprotein(Pgp) expressions in hepatocellular carcinoma cells. METHODS: Based on the design of two fragments of oligonucleotides for shRNA expression which targeted MDR1 gene (shMDR11， shMDR12)， RNAi plasmids (pshMDR1)were constructed and transfected into SMMC7721/R cells by LyoVecTM. Drug sensitivity was measured by MTT assay， Pgp expression and intracellular Rh123 accumulation were determined by flow cytometry(FCM). RESULTS: Recombinant pshMDR1 vectors were identified by PCR and confirmed by sequencing analysis. They could suppress Pgp expression in hepatocellular carcinoma cells. Drug sensitivity was increased significantly after pshRNAMDR1 was transfected in SMMC7721/R cells. The level of Pgp expression was reduced significantly. The intracellular accumulation of Rh123 was increased greatly after pshMDR1 treatment in SMMC7721/R cells. The shMDR11 was more effective in the suppression of MDR1. CONCLUSION: Recombinant pshMDR1 vector can suppress the expressions of MDR1 mRNA and Pgp in SMMC7721/R cells. The inhibitory effect of the shRNA generated from the DNA vector is highly related to the target sites and to the different cell lines. 【Keywords】 RNA interference; drug resistance， multiple; short hairpin RNA; recombination， genetic; plasmids; gene expression 0引言 腫瘤化療失敗的重要原因之一是腫瘤產生多藥耐藥（multi drug resistance， MDR）. 多藥耐藥基因MDR1基因的過度表達是導致腫瘤細胞產生耐藥的重要機制［1-2］. RNA干擾（RNAi）是新近發展起來的一種封閉基因表達的有效方法，它通過將雙鏈RNA（dsRNA）導入細胞后，在Dicer酶的作用下產生有活性的小干擾RNA（siRNA），使與該段RNA同源的目的mRNA產生特異性降解，從而導致特異基因表達抑制的轉錄后基因沉默現象［3-4］. 本實驗我們運用PGE1載體，構建了含多藥耐藥基因（MDR1）的短發夾狀RNA（shRNA）真核表達載體，觀察其對肝癌耐藥細胞株SMMC7721/R的MDR1， P糖蛋白（Pgp）表達的抑制作用. 1材料和方法 1.1材料 肝癌細胞株SMMC7721為同濟醫科大學免疫教研室沈關心教授惠贈，本研究所傳代培養. SMMC7721/R細胞由本室用阿霉素對其敏感細胞株誘導成功后凍存. 宿主菌大腸埃希氏菌SCS1， PGE1質粒及PGE1陰性對照質粒（shneg）， TaqDNA聚合酶，T4DNA連接酶和MgCl2均購自Promega公司，限制性內切酶BamHI和XbaI購自MBI公司，低熔點瓊脂糖購自Gibco公司，小量質粒提取試劑盒和回收質粒純化試劑盒均購自上海申能博彩公司. 轉染試劑LyoVecTM為InvivoGen公司產品，抗Pgp抗體為NeoMarkers產品，FITC標記的羊抗鼠IgG為KPL產品，羅丹明123（Rh123）和四甲基偶氮唑鹽（MTT）為Sigma公司產品. 1.2方法 1.2.1引物的設計針對質粒PGE1序列，利用引物設計軟件設計PCR引物序列，Forward：5′CGT CGA TTT TTG TGA TGC TCG TCA G3′，Reverse：5′GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG3′. 根據GeneBank中的MDR1 mRNA序列設計MDR1引物1：5′ CAGGAGATAGGCTGGTTTGATGGT3′，引物2：5′ TTAGCTTCCAACCACGT GTAAATC3′，其產物為172 bp；引物和DNA片段由上海生工有限公司合成. 1.2.2重組質粒的構建與鑒定 1.2.2.1shRNA的設計與合成按照shRNA的設計原則［5］，根據GeneBank MDR1基因已知序列，選取2段含21 nt的MDR1特異性靶序列作為shRNA目標序列（shMDR11： GGA GGC CAA CAT ACA TGC CTT；shMDR12： GAT CGC TAC TGA AGC AAT AGA），在GeneBank數據庫進行同源序列搜索，以證明其特異性. 合成該目的序列的反向互補序列，中間通過8 nt的回折序列（GAAGCTTG）將此兩段序列相連，形成莖環結構，3′端添加5個T，作為RNA聚合酶Ⅲ的終止子，形成62 nt的寡核苷酸正義鏈. 1.2.2.2pshRNAMDR1重組質粒的構建合成2對62 nt寡核苷酸鏈，溶解在ddH2O中，終濃度為0.2 g/L. 正義鏈和互補鏈的Oligos退火形成雙鏈DNA（dsDNA），分別與經過酶切回收后的PGE1線性載體連接，得到重組質粒，命名為pshRNAMDR11和pshRNAMDR12. 轉化感受態細胞，37℃培養過夜篩選，獲得陽性轉化子菌落. 1.2.2.3重組質粒的鑒定挑選陽性轉化菌落擴增，提取質粒. 用PCR方法初步鑒定，同時設計未帶插入片段的PGE1質粒作為對照. 擴增條件：94℃變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環后，72℃延伸5 min. 取PCR產物和DNA Marker經50 mol/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定. 提取重組質粒，送大連寶生物工程技術服務有限公司進行序列測定. 1.2.3細胞轉染培養調整細胞1×1011/L，接種于6孔板，培養： 100 mL/L小牛血清， 37℃， 50 mL/L CO2；待細胞貼壁至80%匯片后，換入無血清RPMI1640培養基，同時分別加入AB混合液（A液： 一定量20 μL的重組質粒稀釋于100 μL無血清RPMI 1640中；B液：25 μL脂質體稀釋于100 μL無血清RPMI 1640中，混合AB液. ）置室溫孵育30 min，培養5 h后加小牛血清終止轉染，24 h后換完全培養基，然后培養不同時間備用. 同時設立PGE1陰性對照質粒（shneg）轉染組.