【摘要】 幽門螺桿菌(Hpylori，Hp)是慢性胃炎，消化性潰瘍的重要致病因素。研究表明，Hp的根治和清除有利于潰瘍的治愈。而Hp耐藥直接影響Hp的根治和清除，Hp耐大環(huán)內酯類藥物(克拉霉素)的機制與其23S rRNA的V區(qū)上的點突變有關。隨著Hp耐藥率的逐年升高，有關Hp的耐藥分子機制和檢測技術成為研究熱點。因此，開展Hp耐藥的相關研究對Hp的診斷和治療有重大意義。

【關鍵詞】 幽門螺桿菌;耐藥性;克拉霉素;分子機制

克拉霉素是新一代的大環(huán)內酯類抗生素，由于其抗Hp作用強，而成為根除Hp治療方案中的主要藥物。但Hp可對其產生耐藥性，耐藥菌株的出現是導致根除治療失敗的主要原因[1-3]。我國近年才開始應用克拉霉素，Hp原發(fā)耐藥菌株的出現可能主要與同類藥物交叉耐藥有關，治療失敗時大約1/2～2/3的菌株可對其產生獲得性耐藥。因此，研究Hp的耐藥情況、耐藥機制和檢測手段對指導臨床用藥以及療效監(jiān)測顯得十分必要。本文就Hp對克拉霉素耐藥作一綜述。

1 Hp對克拉霉素的耐藥情況

隨著克拉霉素的廣泛使用，Hp的耐藥菌株也逐漸增多。Hp對克拉霉素耐藥率在不同的國家和地區(qū)情況不盡一致。Kobayashi等人[4]研究發(fā)現日本的Hp克拉霉素耐藥率從2002年的18.9%上升到2005年的27.7%，且有明顯的性別差異(P<0.0001)，其中男性19.2%，女性27.0%。他們還發(fā)現克拉霉素耐藥率有地區(qū)差異。Kato等人[5]報道日本兒童的2002年克拉霉素原發(fā)耐藥率為29.0%，Hp敏感菌株和耐藥菌株的根除率分別為89.0%、56.0%。Hp繼發(fā)耐藥率(78%)明顯高于原發(fā)耐藥率(P<0.01)。Kimet等人[6]報道韓國漢城Hp克拉霉素耐藥率由1994年的2.5%上升至2003年的13.8%。Toracchio等人[7]對意大利中部研究發(fā)現克拉霉素原發(fā)耐藥率和繼發(fā)耐藥率分別為23.4%、82.3%，克拉霉素原發(fā)耐藥多見于女性。Elviss等人[8]報道北威爾士2004年的克拉霉素耐藥率為7%，明顯低于歐洲其他地方。Koivisto等人[9]報道芬蘭的克拉霉素耐藥率僅為2%，且與有口腔和呼吸道疾病的用藥史有關。Boyanova等人[10]認為保加利亞的兒童克拉霉素耐藥率和他們的居住地有關，這種差異可能和當地使用大環(huán)內酯類藥物有關，居住在鄉(xiāng)村的兒童克拉霉素耐藥率為22.7%，明顯高于居住在大城市的兒童耐藥率(8.5%)。Osato等人[11]分別用Etest和agar dilution方法研究發(fā)現美國的克拉霉素原始和繼發(fā)耐藥率分別為12%和10.6%，性別和年齡對克拉霉素耐藥有很大影響。Kaneko等人[12]研究顯示在經過多重抗生素(包括克拉霉素)治療的非結核性呼吸道感染患者的克拉霉素耐藥率高達100%，提示應在進行長期的抗生素治療前應根除Hp。Onder等人 [13]對土耳其110例Hp感染者研究發(fā)現，Hp的克拉霉素耐藥率為48.2%，但其耐藥率和性別、年齡、大環(huán)內酯類藥物的使用、居住地、教育狀況無相關性。Go?ciniak等人 [14]研究發(fā)現波蘭1997-2001年的克拉霉素原發(fā)耐藥率8.6%，治療8周后耐藥率達17.6%。中國地區(qū)也存在著地區(qū)和年齡的差異，成虹等人[15]調查發(fā)現北京1999-2000年的克拉霉素耐藥率為10.0%，2000-2001年為18.3%，存在著上升趨勢。陳潔等人[16]對浙江地區(qū)44例兒童臨床分離菌株研究顯示克拉霉素耐藥率為18.2%，兒童耐藥率高于成人。Hao等人[17]2004年報道中國東北地區(qū)克拉霉素耐藥率為23.3%。

綜上所述：(1)各國家或地區(qū)的Hp菌株對克拉霉素原發(fā)耐藥率不同，耐藥率為2%-48%，有明顯的地域差異。克拉霉素耐藥率在漢城、北京、日本、土耳其呈上升趨勢，在意大利、芬蘭、北威爾士呈相對穩(wěn)定狀態(tài)或下降趨勢。(2)盡管有報道兒童克拉霉素耐藥率高于成人，但克拉霉素耐藥是否存在年齡、性別等差別，還存在爭議。(3)目前多數學者認為，克拉霉素繼發(fā)耐藥率明顯高于原發(fā)耐藥率，抗生素(大環(huán)內酯類)的用藥史與Hp交叉耐藥、繼發(fā)性耐藥率的上升有相關性。

2Hp對克拉霉素的耐藥機制

克拉霉素為14環(huán)的半合成新大環(huán)內酯類，因結構上其內酯環(huán)的6位羥基為甲氧基所替代，也稱甲紅霉素。這一結構上的修飾增加了其對酸的穩(wěn)定性及抗菌活性。其作用于細菌核糖體50S亞單位，通過阻斷轉肽作用及mRNA位移而抑制細菌蛋白質的合成。作為根除Hp治療方案的關鍵成分，對該藥的耐藥是治療失敗的主要原因。Bazzoli等人[18]報道克拉霉素敏感株及耐藥株的根除率分別為95%和40%。大環(huán)內酯類抗生素能結合在野生型Hp的50S大亞基的23S單位上，抑制肽基酰基轉移酶，影響核蛋白位移，抑制細菌蛋白合成和肽鏈延伸。而有耐藥性的Hp的23SrRNA 的V 區(qū)上發(fā)生了點突變，導致核糖體的構象改變，使大環(huán)內酯類抗生素結合位點也隨之發(fā)生改變，進而使Hp與大環(huán)內酯類藥物親合能力減粥，藥物也就不能阻止細菌的蛋白合成，最終產生耐藥。最多見的突變位點為A2143G。De Francesco等人[19]在對62株克拉霉素耐藥菌株的研究中發(fā)現35株發(fā)生了A2143G突變(突變率為56.4%)，14株發(fā)生A2142G突變，8株A2142C突變，5株為A2143G和A2142G或A2143G和A2142C的同時突變。Francesco等人[20]還發(fā)現發(fā)生A2143G突變的菌株根除率最低(48%)， 但發(fā)生A2142G或A2142C 突變的菌株根除率仍可達到93%，提示A2143G突變對Hp對克拉霉素耐藥進而影響其根除的作用最大。Posteraro等人[21]應用PCR依賴的高壓液相色譜法檢測到5個突變位點：A2142G，A2142C，A2143G，T2182C和C2195T。其C2195T的突變先前未曾發(fā)現過，此次與A2143G同時出現，顯示克拉霉素仍有新的突變位點產生，其耐藥機制尚需進一步研究。

3 幽門螺桿菌耐藥生物學檢測方法

3.1對Hp耐藥的傳統(tǒng)生物學檢測方法

Hp耐藥的傳統(tǒng)生物學檢測方法是取胃黏膜或組織，細菌增殖培養(yǎng)后，進行Etest、瓊脂稀釋法、紙片擴散法等體外藥敏試驗。Etest操作簡便，但試紙價格昂貴;瓊脂稀釋法技術要求較高;紙片擴散法簡便易行，但結果受多種因素的影響，不夠準確。Hp培養(yǎng)要求高，時間長，不適合臨床常規(guī)開展。Hp耐藥的分子生物學檢測方法建立在檢測其核糖體23S rRNA點突變的基礎上，根據是否需要基因擴增分為：(1)需要用基因擴增產物進行分析的，包括聚合酶鏈限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCRRELP)、DNA測序法(Sequencing)、DNA酶免疫測定法(DNA enzyme immunoassay)、寡核苷酸連接試驗(OLA)、3'端錯配反向PCR(3'MPCR)、實時熒光定量PCR(realtime PCR)、基因芯片法(gene chip)、變性高效液相色譜法(DHPLC)等。(2)不需要用基因擴增產物進行分析的， 如熒光原位雜交(FISH)。1996年Versalovic等首先將PCRRELP用于檢查Hp 23S rRNA的A2142G，A2143G的突變，該法以核糖體23S rRNA點突變?yōu)榛A，通過PCR方法擴增發(fā)生突變的區(qū)域，由于堿基的變異可能導致酶切點的消失或新的切點的出現，利用特異的限制性內切酶(MboⅡ，BsaⅠ)對PCR產物進行酶切，電泳分析，然后根據DNA片段長度的差異作出判斷。該法簡便易行，較為敏感，是檢測AG突變常用的方法，但是該法的準確性受到臨床標本以及非 Hp DNA擴增產物的影響，Alarcón等人 [22]用3'MPCR可以檢測的23S rRNA A2142C的突變，其特點是運用一對特殊的引物。Realtime PCR將雜交技術和實時PCR以及融解曲線分析法三者有機地結合在一起，此方法不易污染，不需酶切，能同時對Hp感染進行定量和耐藥性檢測，而且適合于大量標本的檢查。Elviss等人 [23]用Realtime PCR通過對溶解曲線的判斷準確快速檢測點突變，還比較了3'MPCR、Realtime PCR、PCRRELP，認為用3'MPCR檢測點突變其敏感度和特異度都高于另外兩種方法。DHPLC由Oefner于1995年建立，利用雜合雙鏈和純合雙鏈部分變性溫度不同，可以自動檢測單堿基置換，小片段插入和缺失。 Posteraro等人 [24]用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，能檢測A2142G，A2143G，A2123C，T2182C，C2195T五個位點的突變。臨床實踐證明，DNA測序則是檢測基因突變位點的金標準。

3.2 基因芯片技術對Hp耐藥的檢測

近年來，基因芯片(Gene chip)技術發(fā)展迅速，已廣泛應用于疾病研究、疾病診斷、基因測序、藥物篩選等方面。基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測序技術的基礎上的，其原理是將大量的探針分子固定在支持物上，與標記的樣品DNA進行雜交，可根據堿基互補配對的原則確定靶DNA序列，通過激光共聚集儀掃描，檢測雜交信號的強度和分布進行分析。基因芯片可以實現對上千個基因同步檢測，國內外學者已經在嘗試用該技術檢測Hp耐藥基因，且對Hp基因進行定性、定量及結構分析的研究。國內學者[25]制備和應用寡核苷酸芯片對Hp感染及其致病性相關的基因型和耐藥性同時進行檢測，該法將PCR技術與高通量芯片技術相結合，對檢測對象的多種生物學信息進行檢測，具有快速、高效的特點，具有較高的靈敏度，同時自動化讀取手段可確保檢測的特異性和客觀性，減少人為誤差，這對多種基因的比較研究非常有利。但也存在一些問題：樣品的制備與標記比較繁瑣，芯片的制備較為復雜，儀器昂貴，費用較高等。隨著科學技術的不斷發(fā)展，基因芯片技術也會逐漸成熟和完善，基因芯片技術對Hp耐藥的檢測有著極為廣闊的應用前景。

隨著各國學者對Hp耐藥檢測技術研究的進展，取材方式也經歷了一個發(fā)展過程：(1)胃鏡下取胃組織或黏膜，細菌培養(yǎng)，提取菌株DNA，再進行各種分子生物學方法檢測。(2)直接從胃活檢標本中提取DNA，省去了培養(yǎng)步驟，快速簡便。(3) Chattopadhyay等人[26]報道不需要抽提DNA的實驗方法，胃鏡下取胃黏膜或組織置于無菌塑料管，加120mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，劇烈振蕩2min，開水浴15min后冰上冷卻，13000g離心1min，吸取上清液進行PCR擴增。(4)糞便取材，Fontana用巢式PCR方法對糞便進行擴增[27]，產物用MboⅡ，HhaⅠ，BsaⅠ進行酶切可檢測A2142C/G，T2717C，A2143G的突變.糞便取材屬非創(chuàng)傷性，但由于糞便中Hp含量較低，雜菌較多，尤其是糞便中的膽紅質，膽鹽及一些重金屬離子等可抑制Taq DNA聚合酶的活性，給實驗帶來一定的難度，如何去除抑制物是實驗成功的關鍵.以上取材方式中，胃鏡下取材適用于有內窺鏡檢查指征的患者，如十二指腸潰瘍、早期胃癌等。糞便取材方便且無痛苦，無創(chuàng)傷，尤其適用于對Hp的克拉霉素耐藥性的流行病學查，以建立本地區(qū)的Hp耐藥的流行病學資料，指導臨床合理用藥。

4 結語

隨著抗生素的廣泛適用，Hp的耐藥率逐漸上升。目前，Hp對克拉霉素耐藥的分子機制已基本明確，有關耐藥的檢測手段的研究也較多，但大多數方法費時、繁瑣。因此，研究和建立簡便、快速、準確的耐藥檢測方法，將對建立流行病學資料和指導臨床合理用藥有著重要的作用。基因芯片技術可對多種基因同時、快速進行檢測，且具有高通量、高靈敏度的特點，有著極為廣闊的應用前景。