【摘要】 目的 利用RNA干擾（RNAi）技術來逆轉人白血病K562/ADM細胞多藥耐藥能力的可行性。 設計兩條針對MDR1基因的發夾狀RNA（shRNA），并將其分別構建在pGenSil-1質粒中；然后將這兩條shRNA分別轉染K562/ADM。利用羅丹明外排法、熒光定量PCR來檢測這兩條shRNA對K562/ADM的多藥耐藥性的逆轉作用。結果 在穩定轉染的細胞中可以觀察到不同程度的MDR逆轉現象。在兩個穩定轉染的克隆中，MDR現象被完全逆轉。結論 本研究顯示可以利用shRNA逆轉K562/ADM細胞的多藥耐藥。

【關鍵詞】 多藥耐藥；白血病；shRNA;MDR1

complete reversal of multidrug resistance in leukemia cells by shRNA ZHANG Xue-qin，CHEN Huan，LI Wen-yi.The Songgang People’s Hospital，Bao’an District，Shenzhen 518105，China 【Abstract】 Objective To study the efficiency of reversing MDR with suppressing MDR1 gene with RNAi in K562/ADM cells.Methods For reversing MDR by RNAi technology，two different short hairpin RNAs （shRNAs） were designed and constructed into pGenSil-1 plasmid respectively.They were then transected into the highly adriamycin-resistant K562/ADM cell line.The RNAi effects on MDR was evaluated by real-time PCR，and Rhodamine123 （Rh123） efflux assay.Results The stable transfected clones showed various degrees of reversal of MDR phenotype.Surprisingly，the MDR phenotype was completely reversed in two transected clones.Conclusions This study demonstrates that MDR can be reversed by the shRNA-mediated RNAi in K562/ADM cells， provides a valuable clue as to sensitizing multidrug-resistant hepatoma cells to anti-cancer drugs. 【Key words】 multidrug resistance;leukemia;shRNA;MDR1 多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是導致白血病化療失敗和不良預后的重要原因，克服多藥耐藥的方法之一是使用逆轉劑［1］。但臨床試驗表明，這些藥物很難達到一個理想的效果，主要是因為其毒副作用［2］。近年來，隨著RNAi技術的，利用shRNA完全逆轉部分腫瘤細胞的MDR現象已有報道，本文試圖對這一技術用于白血病細胞的可能性進行研究。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 人紅白血病敏感細胞株K562及多藥耐藥細胞株K562/ADM均購自醫學院天津血液學研究所。TRIzol Reageant試劑盒（Gibco公司），新生牛血清（Hyclone公司），DMEM高糖型細胞培養液（Gibco公司），阿霉素（法瑪西亞公司）。SYBRGreen PCR Master Mix購自美國生物系統公司。逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司。 1.2 細胞培養 細胞在37°C、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養。培養液為含10%熱滅活新生牛血清的RPMI1640細胞培養液。在K562/ADM細胞的培養液中加入濃度為1.0mg/L的阿霉素以維持其耐藥性。 1.3 siRNA的設計及shRNA的構建 利用siRNA設計軟件（網址：http://www.sirna.qiagen.com）設計了兩條序列，分別針對MDR1基因（accession number:M14758）的不同編碼區域。MDR-A:5′-AAC TTT GGC TGC CAT CAT CCA -3′;MDR-B:5′- AAG GCC TAA TGC CGA ACA CAT-3′，分別針對MDR1 mRNA的第586-606及第3494-3514核苷酸區域。這兩個序列分別被構建到一段短的雙鏈DNA序列中（武漢晶賽公司合成，表1）。目的序列作為反義鏈，其正義鏈與反義鏈互補，中間間隔一段長9個核苷酸的發夾環，兩端分別插入終止序列及Hind Ⅲ或BamH1酶切位點。然后將這兩個序列分別插入pGenSil-l（武漢晶賽公司，圖1）質粒中。反應按武漢晶賽公司建議的操作流程進行。 表1 shRNA寡核苷酸片斷的序列（略） 圖1 pGenSil-l質粒的結構。pGenSil-l質粒（略） 1.4 細胞轉染及穩定轉染克隆的篩選 當K562/ADM細胞在六孔板內達到50%~60%滿時進行轉染。具體操作步驟按Lipofectamine 2000TM說明書建議的操作步驟進行。細胞轉染48h后，將細胞轉入直徑10cm的培養板中并加入含400μg/ml G418的培養液（不含阿霉素）進行培養。3周以后，將穩定轉染的克隆挑入96孔板中并擴增。期間利用熒光顯微鏡進行觀察，穩定轉染的克隆發綠色熒光；而沒有穩定轉染的細胞沒有綠色熒光，丟棄這一部分細胞。 1.5 P-gp泵功能檢測 為了觀察轉染細胞的RNAi效果，利用Rh123（Sigma，MO，USA）外排法來檢測轉染細胞的P-gp泵功能，具體操作方法如Broxterman等［3］所述。簡而言之，當細胞在6孔板內達到70%~80%滿時，加入Rh123，其在培養液中的作用濃度為0.20μg/ml，37°C孵育1h，然后將細胞用4°C PBS漂洗3遍后重懸于4°C PBS中，細胞濃度為5~10×105/ml。上流式細胞儀（Becton dickinson immune cytometry systems）檢測10000個細胞內的Rh123熒光強度。激發波長為488nm。每次試驗時利用沒有加入Rh123的K562細胞作為空白對照。通過在M1區域細胞的百分比來鑒定細胞的P-gp泵功能，落在該區域細胞的百分比越高，則該種細胞的P-gp泵功能越強。 1.6 總RNA的提取及逆轉錄反應 在細胞達融合生長的六孔板（此時每個孔的細胞數量大約為1×106個）中加入1.0ml TRIzol Reagent，按其說明書建議的操作步驟提取總RNA，再用DNA酶去除基因組DNA。電泳證實，具有清晰18S和28S條帶的RNA用于逆轉錄試驗。利用Fermentas公司逆轉錄試劑盒合成cDNA，具體操作按試劑盒說明書中的建議進行。cDNA產物-20°C保存。 1.7 熒光定量PCR檢測 內參照GAPDH引物參見［4］。MDR1上游引物為5′-TGG TTC AGG TGG CTC TGG AT-3′，下游引物為5′-CTG TAG ACA AAC GAT GAG CTA TCA CA-3′。反應利用美國應用生物系統公司試劑盒SYBRGreen PCR Master Mix進行。在每個20 μl反應體系中包含SYBRGreen PCR Master Mix 10μl，上下游引物各900nM，cDNA 0.8μl。每種樣本設三個重復孔。反應在美國應用生物系統公司7000型熒光定量PCR儀上進行。數據利用該儀器的相對定量分析軟件進行。利用比較CT法測定mRNA的相對表達程度，以K562細胞的MDR1/GAPDH比值為校正樣本，其值設為1，log101=0.00。 1.8 統計學方法 數據統計學分析采用非配對t檢驗法，在統計軟件SPSS 11.0上進行。熒光定量PCR結果的統計學分析在ABI PRISM 7000熒光定量PCR儀自帶的分析軟件上進行，可信限設定為95%。 2 結果 2.1 shRNA抑制了P-gp泵功能 我們總共檢測了48個pGenSil-1/MDR-A轉染的克隆，68個 pGenSil-1/MDR-B轉染的克隆及10個空pGenSil-1質粒轉染克隆的P-gp泵活性。有兩個pGenSil-1/MDR-B-轉染克隆的P-gp泵活性被抑制到與K562細胞相近的水平，我們將其命名為KB克隆1及KB克隆2，超過60%的pGenSil-1/MDR-B轉染克隆的P-gp泵活性在很大程度上被抑制（43/68），但是有5個克隆的P-gp泵活性沒有被顯著地抑制。pGenSil-1/MDR-A轉染的細胞克隆的RNAi效果較差，沒有P-gp活性被完全抑制的細胞克隆。空pGenSil-l質粒轉染細胞克隆的P-gp則沒有被明顯地抑制（圖2）。 2.2 shRNA降低了MDR1 mRNA水平 為了進一步證實Rh123外排法的測定結果，我們利用熒光定量PCR技術檢測轉染細胞克隆的MDR1 mRNA 的表達水平。我們分別檢測了K562細胞， K562/ADM細胞 KB克隆1、KB克隆2及一個空質粒轉染的克隆的MDR1 mRNA表達水平。結果顯示：KB克隆1、KB克隆2的MDR1 mRNA水平明顯降低，與K562/ADM細胞相比，其MDR1 mRNA分別下降了93%及92%，而空質粒轉染的細胞克隆MDR1 mRNA的表達水平僅下降了40% （圖3）。 3 討論 化療是白血病的一個主要手段。，盡管不斷有新的化療藥物和化療方案推出，但白血病細胞對多種化療藥物產生的多藥耐藥性仍是化療失敗的主要原因，至今仍為治療白血病的一大難題。有學者利用中藥、反義寡核苷酸、核酶等技術來逆轉MDR，但因效率低、專一性不強、使用量大等缺點，效果不甚理想。本研究應用最新的基因封閉方法RNAi技術來抑制K562/ADM細胞的MDR1基因表達。 siRNA具有抑制作用強、穩定性高等優點，正逐漸取代反義核酸，成為新的研究熱點［5］。哺乳動物細胞誘導RNAi的關鍵在于如何有效合成siRNA。目前，化學合成的siRNA費用較高、抑制作用短暫<