作者：孔令偉，范忠澤，許建華，孫 玨，朱美華，李 琦，韓建宏，石曉蘭

【摘要】 目的 觀察中藥復方腸胃清口服液對腫瘤多藥耐藥的逆轉作用，以及對瘤組織和正常組織中化療藥物分布的影響，探討中藥增效減毒的作用機制。方法 將具有多藥耐藥表型的人口腔表皮癌細胞株KB-A-1皮下注射接種于裸小鼠右側腋下，隨機分為5組：空白對照組，腸胃清組，阿霉素組，阿霉素+低濃度腸胃清實驗藥物組，阿霉素+腸胃清高濃度實驗藥物組。腫瘤稱重、HPLC分析、流式細胞儀檢測各組藥物的抑瘤率、阿霉素在腫瘤組織與肝腎中的分布及腫瘤細胞的凋亡率。結果 阿霉素和腸胃清單獨給藥均不能抑制腫瘤組織的生長，阿霉素與腸胃清聯合治療能顯著減少腫瘤組織的重量，增加腫瘤組織內的阿霉素濃度，誘導腫瘤細胞發生凋亡。阿霉素與腸胃清聯合治療沒有影響肝臟和腎臟組織阿霉素濃度。結論 腸胃清在不影響正常組織阿霉素濃度的同時，通過增加阿霉素在腫瘤細胞內的積累而增強阿霉素的細胞毒性，從而抑制腫瘤組織的生長，逆轉腫瘤的耐藥。 【關鍵詞】 腸胃清口服液；人口腔表皮癌細胞KB-A-1；多藥耐藥 【Abstract】 Objective To observe the effect of Changweiqing oral liquid(CWQ) on reversal of mulitdrug resistance and the effect on concentration of DOX(doxorubicin) in tumor and normal tissue. Methods The human oral epidermoid carcinoma cell lines KB-A-1， which were mulitdrug resistance， were injected s.c. into the right flank area of the nude mice， which were randomized into 5 groups： control group， CWQ group， DOX group ，DOX plus CWQ (12.5g/kg) group and DOX plus CWQ (50g/kg) group. The tumor masses were weighted and the tumor inhibition rates were calculated； the concentration of DOX in tumor and normal tissue( livers and kidneys) were analyzed by high performance liquid chromatography； the apoptotic rate of cancer cells were detected by flow cytometry.Results The growth of tumors was not inhibited in DOX and CWQ groups， the weight of tumor masses were all smaller in DOX plus CWQ (12.5g/kg) group and DOX plus CWQ (50g/kg) group than that in other groups.The concentration of DOX in tumor and the apoptotic rate in cancer cell were all higher in DOX plus CWQ group than that in other groups. There were no significant difference between the concentration of DOX in livers and kidneys of every groups.Conclusion CWQ can inhibit the growth of tumor and reverse mulitdrug resistance of tumor by increasing the concentration of DOX in tumor ， while the concentration of DOX in normal tissues didn’t change. 【Key words】 Changweiqing oral liquid；human oral epidermoid carcinoma KB-A-1；mulitdrug resistance 多藥耐藥（multidrug resistance， MDR）是腫瘤化學治療提高療效的最大障礙，許多化療增敏劑在提高療效的同時，往往存在嚴重的毒副作用，限制了臨床應用［1］。許多研究表明，中醫藥在輔助化療藥治療惡性腫瘤時，一方面可增強化療藥的治療效果，另一方面可減輕化療藥的毒副作用，其機制尚未被完全闡明，是否對腫瘤組織和正常組織中化療藥分布有不同的影響尚未見報道［2］。我們既往的研究表明，中藥復方腸胃清口服液可抑制移植瘤的生長，并可明顯提高小鼠脾臟及胸腺指數［3］，本研究建立多藥耐藥移植瘤模型，重點觀察腸胃清對化療藥的增效作用，以及對瘤組織和正常組織中化療藥分布的影響，闡明腸胃清增效減毒的作用機制。 1 材料與方法 1.1 材料 細胞株：KB-A-1是人口腔表皮癌耐藥細胞系。此細胞株由Ira Pastan博士和Micheal.M. Gottesman博士饋贈（National Institutes of Health， USA）。細胞置于培養箱，在37℃，5% CO2＋95％空氣條件下培養。培養基為DMEM，加入10%小牛血清，加入氨芐青霉素、硫酸鏈霉素至終濃度各100u／ml，培養基中加入1.0μg/ml 阿霉素（doxorubicin，DOX）。動物：BLAB/c nu/nu 裸小鼠，雄性，4～6周齡，由中國科學院上海實驗動物中心提供，按照SPF條件飼養。腸胃清口服液由黃芪、黨參、白術、石見穿、野葡萄藤等藥物組成，由上海中醫藥大學附屬普陀醫院制劑室提供，生藥濃度為1.33g/ml。 1.2 人表皮癌細胞KB-A-1異種移植模型的建立［4］ 單層培養細胞用胰蛋白酶消化，用PBS懸浮混勻至約3×107cells/ml，以5×106cells/0.2ml濃度皮下注射接種于裸小鼠右側腋下，3周后，處死動物，迅速將腫瘤組織解剖下來，剪碎，通過網篩過濾，用PBS吹打成2×107cells/ml細胞懸液，以2×106 cells/0.1ml濃度皮下注射接種于裸小鼠右側腋下，當腫瘤組織生長到5mm×5mm大小時開始給藥處理。 1.3 動物分組及治療方法 將上述長有腫瘤的裸小鼠隨機分為5組，每組6只，分別是：①空白對照組：注射生理鹽水（腹腔注射），每天1次；②腸胃清組：（50g/kg，每天1次灌胃，第1～9天給藥）；③DOX組：（2mg/kg，腹腔注射，每天1次，第2、4、6、8天給藥）；④DOX+低濃度腸胃清實驗藥物組：（腸胃清為12.5g/kg，給藥方案同②組；DOX的給藥方案同③組）；⑤DOX+腸胃清高濃度實驗藥物組：（腸胃清為50g/kg，給藥方案同②組；DOX的給藥方案同③組）。 在DOX和腸胃清同時需要給藥日，腸胃清腹腔注射后5h再腹腔注射DOX。每隔3天稱量1次體重，并記錄對動物的行為觀察。全部動物在給藥處理后18天時用乙醚麻醉后處死，迅速取出腫瘤稱重。 1.4 腫瘤和正常組織內DOX濃度的測定 通過HPLC分析，對腫瘤、肝臟和腎臟內的DOX濃度進行定量測定，以確定腸胃清對DOX在被移植腫瘤的裸小鼠體內的分布的影響。具體實驗步驟如下：在裝有0.02M KH2PO4緩沖液（pH3.8）中，將取出組織以1：5 W/V比例充分勻漿，加入30μl KH2PO4、60μl 33% AgNO3、40μl 內標（柔紅霉素，daunorubicin）和390μl 80％乙腈水溶液至300μl組織勻漿液，旋渦振蕩2min以混合均勻，3000rpm，4℃離心10min以沉淀蛋白質，去100μl用于HPLC分析，HPLC體系為：熒光檢測器，激活波長495nm，發射波長560nm；固定相為C18反相柱（5μm，安捷倫）250mm×4.6mm；流動相為5mM 磷酸／甲醇／異丙醇／乙腈（8：7：3：2，體積比）；流速為0.7ml/min。每個樣品測定3次，取平均值.數據以DOX峰面積與內標峰面積的比值表示，計算出組織內的DOX濃度。 1.5 腫瘤組織內凋亡的檢測 腫瘤組織被稱重后立即置于10ml預冷的PBS（含有0.2%牛血清白蛋白、0.01mol/l EDTA和10mg/ml脫氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I）剪碎組織，在玻璃勻漿器中充分勻漿，緩慢通過40μm孔徑尼龍膜，過濾，濾過的液體以500×g，在室溫下離心10min，用500μl含有BSA的PBS吹打沉淀成為細胞懸液，轉移至新的Eppendorf管中，用預冷的70％乙醇（溶解于PBS）在4℃固定8h，加入RNase （終濃度為20μg/ml）在37℃溫育30min，用終濃度為50μg/ml的碘化丙錠（propidium iodide，PI）染色，使用FACS Calibur 流式細胞儀檢測DNA含量，CELLQUEST 軟件分析數據并作圖，亞二倍體峰被定量，作為測定凋亡的標準。 1.6 統計學方法 數據以平均值±標準偏差表示，通過t檢驗和ANOVA檢驗分析。P<0.05被認為具有統計學意義。 2 結果 2.1 腸胃清對體內MDR腫瘤的增殖抑制作用 研究結果如表1所示，DOX和腸胃清分別單獨給藥治療均不能抑制腫瘤組織的生長，它們的瘤重抑制率分別只有4.55%和3.15%。與此相對，DOX與腸胃清聯合給藥治療則能夠顯著減少腫瘤組織的重量，瘤重抑制率接近50％，經統計學處理差異有非常顯著性（P<0.01）。

2.2 腸胃清對腫瘤和正常組織中的阿霉素濃度的影響 結果如圖1所示，DOX與腸胃清聯合給藥組的腫瘤組織內的DOX濃度比DOX單獨給藥組的高61％（P<0.01）。在DOX單獨給藥組和DOX與腸胃清聯合給藥組中，肝臟和腎臟組織內的DOX濃度均沒有明顯變化（P＞0.05）。

2.3 腸胃清對腫瘤組織中阿霉素誘導凋亡的增強作用 如圖2，3所示，腸胃清和DOX均能誘導腫瘤細胞的凋亡，與對照組相比差異有顯著性（P<0.05或P<0.01），腸胃清與DOX聯合給藥組的凋亡水平明顯增高，比DOX單獨給藥組高175％（P<0.01）。

3 討論 通過建立人表皮癌細胞異種移植模型，我們對腸胃清在體內逆轉MDR的效應進行了評價。DOX和腸胃清分別單獨給藥治療均不能抑制腫瘤組織的生長，它們的瘤重抑制率分別只有4.55%和3.15%。與此相對，DOX與腸胃清聯合給藥治療則能夠顯著減少腫瘤組織的重量，瘤重抑制率接近50％。結果顯示DOX與腸胃清聯合給藥后能夠有效地逆轉體內腫瘤細胞的MDR表型。 MDR細胞的一個顯著特點就是：腫瘤細胞內的抗癌藥物濃度水平很低，而且這些藥物的流出速率比敏感性細胞快。MDR的腫瘤細胞就是通過提高藥物流出的速度和降低藥物流入細胞的速度，使細胞內實際作用的抗癌藥物濃度顯著降低，從而減弱了抗癌藥物在細胞內的細胞毒性作用［5］。因此，耐藥性細胞KB-A-1的多藥耐藥性是與胞內的抗腫瘤藥物濃度降低直接相關的。為了研究腸胃清在體內逆轉腫瘤MDR的作用機制，通過HPLC定量分析，我們考察了腸胃清對裸小鼠體內的腫瘤組織中的DOX濃度的影響。研究表明DOX與腸胃清聯合給藥組的腫瘤組織內的DOX濃度比DOX單獨給藥組高61％，這一結果表明，腸胃清能夠在體內顯著增加耐藥型腫瘤細胞KB-A-1對抗腫瘤藥物DOX的敏感性。 在以往的研究中，人們發現很多MDR逆轉劑在臨床試驗中表現出嚴重的毒副作用如心臟毒性，或者增加抗腫瘤藥物引發的對正常組織的毒性作用。因此，為了考察腸胃清是否會增加DOX對正常組織的毒性作用，我們同時還檢測了肝臟和腎臟組織（作為正常組織的代表）內的DOX濃度。實驗結果表明，在DOX單獨給藥組和DOX與腸胃清聯合給藥組中，肝臟和腎臟組織內的DOX濃度都沒有明顯變化。這一發現提示，在被移植腫瘤的小鼠體內，腸胃清似乎沒有增加DOX所引發的對正常組織的毒性作用。 作為常用化療藥物的DOX，在一個較低的濃度下，具有誘導凋亡的細胞毒性作用，其作用機制是DOX分子結構的平面部分嵌入到DNA的雙鏈中形成穩定的復合物，影響DNA的結構和功能，阻止DNA復制和RNA的合成，還能抑制拓撲異構酶Ⅱ的功能，從而抑制腫瘤細胞的分裂和增殖［6］。我們采用流式細胞儀的方法定量測定了腫瘤細胞的DNA含量的變化，以亞二倍體的峰作為凋亡的標準。說明腸胃清能夠增強DOX的細胞毒性作用，誘導腫瘤細胞發生凋亡。腸胃清的這種化學增敏作用與我們觀察到的腫瘤組織內的DOX濃度增加的結果是一致的，進一步說明腸胃清通過增加DOX在腫瘤細胞內的積累而增強了DOX的細胞毒性，從而抑制了腫瘤組織的生長，導致瘤塊重量顯著減少，耐藥性得以被逆轉。

1 Thomas H，Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer：an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoptotein.Cancer Control，2003，10(2)：159-165. 2 侯麗，陳信義.中醫藥逆轉腫瘤多藥耐藥特性與前景分析.中國中醫基礎醫學雜志，2004，10（4）：79-81. 3 許建華，李朝衡，朱美華，等.腸胃清口服液抗腫瘤作用研究.中藥藥理與臨床，2004，20(4)：42-43. 4 Zhang Q， Wei D， Liu J. In vivo reversal of doxorubicin resistance by (-)-epigallocatechin gallate in a solid human carcinoma xenograft. Cancer Letters， 2004，208(2)：179-186. 5 Salama NN，Eddington ND， Payne D， et al.Multidrug resistance and anticonvulsants： new studies with some enaminones. Curr Med Chem，2004，11(15)：2093-2113. 6 Mizutani H， Tada-Oikawa S， Hiraku Y，et al. Mechanism of apoptosis induced by doxorubicin through the generation of hydrogen peroxide. Life Sci，2005，76(13)：1439-1453.