【摘要】 目的 研究中藥復方莪芪抗瘤方劑在體外對白血病HL-60細胞凋亡的作用，并探討凋亡發生與細胞內Ca2+、Caspase-3、Bcl-2的關系。方法 通過血清藥理學方法，選擇10%濃度的含藥血清與白血病HL-60細胞共同培育24、48、72、96 h后，應用熒光顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞儀檢測凋亡峰(亞二倍體峰)，用Fura-2熒光負載方法測定細胞內Ca2+濃度的變化。比色法檢測凋亡相關基因Caspase-3活性變化。親和免疫組化LSAB 法檢測HL-60細胞Bcl-2基因表達。結果 10%濃度的含藥血清處理組細胞體積縮小，細胞核固縮，膜起泡，核斷裂及形成凋亡小體等，以72 h最為明顯；可見DNA含量低于G1期的凋亡細胞群，這群細胞的凋亡百分率隨時間的遞增而增加。10%濃度的含藥血清處理組的細胞內Ca2+濃度也明顯高于對照組(P<0.01)，Caspase-3濃度明顯高于對照組(P<0.01)，Bcl-2基因表達明顯低于對照組(P<0.05)。結論 莪芪抗瘤方劑含藥血清誘導白血病HL-60細胞發生凋亡，這種變化可能與細胞內Ca2+、Caspase-3水平上調及Bcl-2表達下調有關。

【關鍵詞】 莪芪抗瘤方劑；白血病；Caspase-3；Bcl-2

Abstract：Objective To explore the apoptotic effect of Eqi compound prescription (contained-herb serum) on cute myelocytic leukemia HL-60 cell， which is relative to intracellular Ca2+， Caspase-3 and Bcl-2. Methods According to serum pharmacology， HL-60 cells were exposed to 10% concentrations of contained-herb serum for 24， 48， 72 and 96 hours respectively. Cells were observed under a fluore- scence microscope. SubG1 DNA was examined by flow cytometer. Intracellular Ca2+ concentration was measured by fura-2 fluorescence load method. Caspase-3 enzymatic activity were measured by colorimetry. Bcl-2 gene expression were measured by LSAB. Results The contained-herb serum could induce apoptosis of HL-60 cells. Intracellular Ca2+ concentration of treatment with Eqi was higher evidently than that of control (P<0.01). Caspase-3 gene expression of treatment with Eqi was higher evidently than that of control (P<0.01). Bcl-2 gene expression of treatment with Eqi was lower evidently than that of control (P<0.05). Conclusion According to serum pharmacology， Eqi compound prescription could induced apoptosis of acute myelocytic leukemia HL-60 cell， which is relative to up-regulating Ca2+， Caspase-3 and down-regulating Bcl-2.

Key words：Eqi compound prescription；acute myelocytic leukemia；apoptosis；Caspase-3；Bcl-2 越來越多的研究表明，細胞內Ca2+水平升高與誘發細胞凋亡密切相關[1]。細胞內凋亡相關基因Caspase-3活性變化對凋亡的誘導起重要促進作用[2]。Bcl-2 是重要的抑凋亡基因之一，過度表達Bcl-2的急性白血病細胞抑制凋亡[3]。本實驗主要觀察莪芪抗瘤方劑(含藥血清)對白血病HL-60細胞內Ca2+濃度、促凋亡基因Caspase-3活性及抑凋亡基因Bcl-2表達的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

日本大耳白兔，雄性，體重2.5～3 kg，蘭州醫學院實驗動物室提供。

1.2 藥物

莪芪抗瘤方劑由莪術、三棱、黃芪、女貞子等藥物組成，甘肅省藥材公司飲片廠提供，按工藝制成每1 mL含原藥材5 g的浸膏，4 ℃保存備用。

1.3 含藥血清的制備

以純種雄性日本大耳白兔10只，每日給予含莪芪抗瘤方劑浸膏10 g/kg灌胃，另設3只為對照組(生理鹽水組)。連續10 d，于最后一次灌藥后1 h(灌藥前禁食、不禁水12 h)，心臟采血并分離血清，經56 ℃、30 min滅活，無菌過濾后，置-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 細胞培養

HL-60細胞由蘭州醫學院血液病研究所傳代保存，采用常規培養。培養液為含10%的小牛血清，青、鏈霉素各100 U/mL的RPMI-1640，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2孵箱中培養，每2～3 d換液傳代培養。

1.5 細胞形態學觀察

參照文獻[4]方法略加改動，將細胞以1×104接種于96空板中，24 h細胞貼壁后，棄上清。加入10%的含藥血清培養基處理細胞，另設未加藥對照組。每12 h收集對照及藥物處理組細胞，離心涂片，用無水乙醇固定10 min后，加1.2 μg/mL吖啶橙染色30 min，于熒光顯微鏡下觀察細胞染色質及RNA變化并拍照。

1.6 流式細胞術分析

參照文獻[5]略加改動，離心收集1×105個細胞，將細胞懸于200 μL冷PBS中，冰凍的體積分數為70%的乙醇2 mL于4 ℃固定24 h，離心收集細胞，重懸于500 μL PBS，另加入RNA酶(100 mg/mL)， 0.1%Triton X-100緩沖液，37 ℃孵育30 min， 4 ℃，50 mg/mL碘化丙錠染色30 min，流式細胞儀(EPICS XL；Coulter，USA)檢測DNA含量。

1.7 細胞內Ca2+濃度測定 參照文獻[6]方法進行。用100 mL 培養瓶，接種5×105個細胞/瓶，藥物處理24 h后，每12 h收集對照及藥物處理組細胞，用胰蛋白酶消化，兩瓶細胞收集成一組，每組調整細胞濃度1.5×106個細胞/mL，用含0.2牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培養液3 mL制成細胞懸液。設定發射波長500 nm，光柵10 nm，在37 ℃下用激發波長為340 nm和380 nm測定自發熒光；加Fura-2/AM(終濃度為1.67 μg/mL)5 μL，37 ℃恒溫振蕩45 min；加Fura-2/AM擴散入細胞膜后其脂溶性基團AM被酯解，釋放出Fura-2， Fura-2最大激發波長為380 nm，而與細胞內游離Ca2+結合后最大激發波長移至340 nm，離心，去上清，用HBSS-BSA緩沖液洗滌2次，加3 mL HBSS-BSA緩沖液制成細胞懸液，用上述2個激發波長測定負載Fura-2的熒光強度；然后加Triton X-100 15 μL裂解細胞，測這2個激發波長的最大熒光強度，最后加0.1 mol/L EGTA(pH 8.7)500 μL絡合Ca2+測這2個激發波長的最小熒光強度。根據文獻[6]制定的公式計算細胞內Ca2+濃度。

1.8 Caspase-3活性檢測

分別收集誘導組、未誘導組2×106個細胞，1000 r/min×5 min，棄上清。將細胞重新懸浮于50 μL冷細胞裂解緩沖液中，冰上放置10 min。4 ℃下12 000 r/min離心10 min，以去除細胞碎片。將上清轉移至另一微離心管中，置于冰上。每組加入50 μL的2×反應緩沖液/DTT混合液。每管加入5 μL的1 mmol/L Caspase-3底物(DEVD-pNA，終濃度50 μmol/L)。水浴37 ℃孵育1 h。設立一個平行管不加底物，在405 nm波長下讀取OD值。根據試劑盒說明所得斜率值(ΔOD/ΔnmolpNA)計算Caspase-3活性單位。

Caspase-3活性單位=(誘導組OD-未誘導組OD)/斜率

1.9 Bcl-2 基因表達測定 親和免疫組化LSAB法檢測10%的含藥血清處理組和未加藥對照組的HL-60細胞Bcl-2 基因表達，胞漿染為棕黃者為陽性細胞，油鏡下隨機計數300個細胞，計算陽性細胞數。

1.10 統計學方法

數據以x±s表示，用SPSS10.0軟件進行組間t檢驗。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡觀察結果 莪芪抗瘤方劑(10%含藥血清)經處理HL-60細胞24、48、72、96 h后，吖啶橙(AO)熒光觀察可見，表現凋亡細胞的特征性形態變化：細胞體積縮小，細胞核固縮，膜起泡，核斷裂及形成凋亡小體等，以72 h最為明顯。

2.2 流式細胞儀分析HL-60細胞DNA含量 莪芪抗瘤方劑(10%含藥血清)經不同時間處理后，可見DNA含量低于G1期的凋亡細胞群，這群細胞的凋亡百分率隨時間的遞增而增加。對照組凋亡率4.7%，莪芪抗瘤方劑(10%含藥血清)分別處理HL-60細胞48、72 h后， 凋亡率分別為13.2%、23.1%。

2.3 細胞內Ca2+濃度測定

(見表1)表1 10% 含藥血清作用于HL-60細胞不同時間細胞內Ca2+ 濃度檢測結果(略)注：組間比較，P<0.01(下同)。

2.4 Caspase-3活性測定

(見表2)表2 10% 含藥血清作用于HL-60細胞不同時間對Caspase-3 活性的影響(略)

2.5 Bcl-2 基因表達測定

(見表3)表3 10% 含藥血清作用于HL-60細胞不同時間對Bcl-2表 達的影響(略)

3 討論

20世紀80年代中期，Iwama H等[7]提出的“血清藥理學”方法實現了體外與體內實驗的結合，其實驗結果與體內實驗有較好的一致性。筆者采用該法對莪芪抗瘤方劑誘導HL-60細胞凋亡進行了實驗研究。通過熒光染色、流式細胞儀分析測試發現，莪芪抗瘤方劑10%含藥血清具有誘導白血病HL-60凋亡的作用，這種作用呈時間依賴性；細胞內游離Ca2+的動態變化在誘發凋亡機制的多個方面起重要作用；Ca2+作為第二信使參與磷脂酰肌醇系統、鈣調蛋白系統或線粒體/細胞色素C介導途徑的凋亡信號傳遞；作為金屬輔助因子激活鈣依賴性的核酸內切酶，使DNA降解或激活轉錄因子而參與凋亡的基因表達。在凋亡程序啟動及執行過程中，稱為凋亡效應器的Caspases蛋白酶家族起了非常重要的作用，直接參與凋亡早期啟動，凋亡信號的傳遞以及凋亡晚期作用于不同凋亡底物，產生細胞皺縮、膜出泡、DNA 斷裂等凋亡特征現象[8]。調亡的發生發展是受基因調控的，在參與調控的多種癌基因和原癌基因中，原癌基因Bcl-2是抑制細胞凋亡的主要基因之一，Bcl-2高表達可延長白血病細胞存活時間，抑制凋亡[9]。本研究結果顯示，莪芪抗瘤方劑10%含藥血清在誘導人類早幼粒白血病細胞株HL-60凋亡過程中，細胞內游離Ca2+水平明顯升高、Caspase-3活性增加、Bcl-2表達下調；表明其含藥血清誘導HL-60凋亡可能依賴于細胞內Ca2+、Caspase-3水平上調，Bcl-2表達下調。