作者：張富軍，任娟，王飛苗，呂社民，李冬民

【摘要】 目的 探討不同抗原修復法對DA.1U大鼠肝組織內核受體檢測結果的影響。方法 應用微波修復法、高壓修復法、酶修復法和高壓加酶修復法對DA.1U大鼠肝組織切片進行修復，然后進行免疫組化染色。結果 DA.1U大鼠肝組織內核受體LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR經高壓抗原修復后，染色陽性強度較其他修復方法明顯增強，而且定位較佳。結論 在核受體免疫組化染色中高壓抗原修復法染色效果優于其他抗原修復法。

【關鍵詞】 核受體；免疫組織化學；抗原修復 ABSTRACT: Objective To explore the effects of different methods of antigen retrieval on the results of immunohistochemical staining of nuclear receptors. Methods Antigens were retrieved by using microwave oven， autoclave， enzyme and autoclave plus enzyme， respectively， in liver sections from DA.1U rats， followed by immunohistochemical staining. Results After antigen retrieval with autoclave， the positive staining intensity of nuclear receptors LXRα， LXRβ， PPARγ and FXR in the liver sections from DA.1U rats was enhanced obviously， and the location of nuclear receptors was better by using this method than the others. Conclusion In the immunohistochemical staining of nuclear receptors， using autoclave to retrieve antigens is the best method.

KEY WORDS: nuclear receptor; immunohistochemical staining; antigen retrieval

核受體在生物體內廣泛分布，與配體結合后活化，調控基因的表達，在機體生長發育、新陳代謝等生理過程中發揮重要作用。核受體LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR在糖、脂代謝調控中起重要的作用，參與2型糖尿病的發生發展。

免疫組織化學染色是根據抗原與抗體特異性結合的原理，用標記的特異抗體對組織細胞內抗原進行定位、定性及定量研究。甲醛溶液固定導致許多抗原決定簇被掩蓋，不能與抗體很好結合。核受體位于核內，鏡下觀察染色結果時，若隱若現，抗原表達不均勻。為了解決該問題，使抗原決定簇能很好的暴露出來，我們采取了微波修復法、高壓熱修復法和酶修復法等。抗原修復方法對DA.1U大鼠肝組織切片進行修復；比較分析不同抗原修復法對DA.1U大鼠肝組織內核受體免疫組化染色結果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Olympus DP71圖像分析儀。LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR抗體購自Abcam公司；免疫組化(SP法)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 組織材料 病理切片來自DA.1U大鼠糖尿病模型肝組織，經40g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，5μm厚，每個蠟塊各切5片。

1.3 抗原修復

組織切片常規脫蠟至水，3%(體積分數)H2O2滅活內源性過氧化物酶，0.02mol/L PBS沖洗后抗原修復。

1.3.1 微波修復法

將切片插入塑料切片架，放置于盛有150mL 0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的容器中，置微波爐內加熱1min 40s，使緩沖液溫度保持于82℃以上。取出切片架，室溫放置3min，然后將切片架置于涼水中冷卻15min。

1.3.2 高壓修復法

將切片插入金屬架，放置于盛有400mL 0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的燒杯中，將燒杯放入高壓鍋內，蓋鍋、壓閥。待煮沸噴氣后，計時2～3min，然后將壓力鍋端離電爐，自然冷卻20min后取出切片。

1.3.3 酶修復法

將復合消化液滴加于切片組織上并完全覆蓋，將切片放入濕盒內，37℃溫箱中消化10min。

1.3.4 高壓加酶修復法

按上述方法高壓修復后取出切片，蒸餾水沖洗，PBS洗2min×3次后，將復合消化酶滴加于切片組織上并完全覆蓋，將切片放入濕盒內，37℃溫箱中消化3min。

1.4 免疫組織化學染色

經上述步驟處理后的切片均用PBS沖洗3次，各5min；滴加正常動物血清封閉液，室溫放置20min，甩去多余液體；每張切片滴加Ⅰ抗30μL，4℃過夜，次日37℃復溫45min，PBS沖洗2min×3次；每張切片滴加生物素標記Ⅱ抗30μL，37℃ 20min，PBS沖洗5min×3次；滴加鏈酶親和素過氧化物酶復合物，37℃ 20min，PBS沖洗5min×3次；DABH2O2顯色，在顯微鏡下控制染色程度，自來水沖洗10min；蘇木素復染。以PBS替代Ⅰ抗作為陰性對照。

2 結 果

核受體LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR均表達于核內，以核內出現棕黃色或棕色顆粒為陽性。對4種核受體抗原采用4種抗原修復方法，以PPARγ為例說明(圖1)：①陰性對照，未見特異性免疫染色，肝細胞核均被蘇木素染為藍色；②不修復，可見肝細胞核均為藍色，未見棕色顆粒；③微波修復，在少數肝細胞質中出現棕色顆粒，核仍為藍色，定位不準確；④酶修復，采用復合消化液修復肝組織后，細胞核未被染色；⑤高壓修復，該法修復肝組織切片后，染色強度明顯強于其他修復法，而且背景清晰；⑥高壓加酶修復，通過該法修復后，肝組織染色強度強，但是組織碎裂，且背景深。LXRβ免疫組化染色結果見圖2。

3 討 論

甲醛固定時，蛋白質的自由氨基與醛基形成羧甲基，或蛋白質氨基酸殘基在分子內或分子間形成醛鍵，使得蛋白質抗原決定簇部分被封閉，無法表達出來，影響免疫組化的結果[1]。抗原決定簇是否充分暴露，是決定免疫組化結果的關鍵因素。為了更好地暴露抗原，目前世界公認的方法就是進行抗原修復。抗原修復方法主要包括熱修復和酶修復。高溫抗原修復方法機理復雜，高壓可使交聯斷裂或折疊的肽鏈解開，從而暴露抗原決定簇[2]；微波場內離子或極性分子直接碰撞，使扭曲、折疊的異常結構恢復正常[3]。熱修復法比較穩定，因高壓修復法避免了外界環境對溫度的影響，在染色強度和重復性方面優于微波修復法[4]。酶修復法則是通過溶解抗原表面的變性蛋白使之暴露，但是酶消化時間因組織不同而異，不易控制，結果不穩定。在抗原修復過程中仍需注意：①抗原修復液的選擇：在修復過程中應加入足夠的修復液防止干片，一般選用檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)，它適用于大多數抗原，修復效果佳。②抗原修復溫度及時間的選擇：有研究表明，溫度達到92℃以上才能使甲醛固定的蛋白抗原修復，一般應保持在92℃～98℃。有效溫度持續時間長短應因抗原修復方法不同而不同，一般微波修復法溫度不好控制，抗原修復液易沸騰，容易脫片，應嚴密觀察；高壓修復時，盛有抗原修復液的燒杯隔水放在高壓鍋內，壓閥噴氣2～4min，溫度容易控制，效果佳。③抗原修復液應自然冷卻：抗原修復持續高溫過后應自然降溫，慢慢恢復蛋白原構型。抗原修復作用廣泛，不僅可以用于免疫組化，尚能用于末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(Tunel)、原位雜交(ISH)和熒光原位雜交(FISH)的檢測，以及樹脂包埋的半薄和超薄切片的免疫組化檢測和非交聯劑固定的活細胞和細胞涂片中抗原的檢測等領域。

本試驗嘗試了4種抗原修復方法，結果表明在核受體免疫組化中，高壓抗原修復法結果穩定，優于酶修復法及微波修復法，染色較強，定位準確，背景清晰。所以，應當根據不同的抗原特征，合理選擇抗原修復方法。