作者：肖鳳霞，鄧少東，田青，鄧超明1，周改蓮

【摘要】 目的 建立庫侖陣列電化學(xué)高效液相色譜法快速測定大鼠腦組織中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。方法 采用庫侖陣列電化學(xué)檢測器檢測去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5HT)、5羥吲哚乙酸(5HIAA)，采用Phenomenex C18反相色譜柱(150 mm×4.60 mm，5 μm)，流動相為緩沖液乙腈(體積比87∶13)，流速為1 mL·min-1，柱溫為35 ℃。結(jié)果 4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的最低檢測限為0.015 15～0.018 15 ng ，回收率為85.3 %～100.5 %。結(jié)論 該法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、樣品制備簡便等優(yōu)點，可用于大鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分離檢測。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法;單胺類神經(jīng)遞質(zhì);庫侖陣列電化學(xué)檢測器

(1.School of TCM，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510006，China; 2.Taishan Medical University，Taian，Shandong 271016，China)Abstract:Objective To establish a rapid method for determining monoamine neurotransmitters in rats’ brain tissue by HPLC with coularray detector.Methods HPLC was performed on a Phenomenex C18 column(150×4.60 mm，5 micron). The mobile phase，consisted of acetonitrilewater phase(13∶87)，was at a flowrate of 1 mL·min-1. The column temperature was kept at 35 ℃. The levels of NE，DA，5HT and 5HIAA were determined.Results The minimum measurement limit was 0.015 15-0.018 15 ng. The average recoveries were 85.3 %-100.5%.Conclusion This method is rapid，accurate，highly sensitive and easy to operate. The procedure is suitable for determining the monoamine neurotransmitters in rats’ brain tissue.

Key words:HPLC; monoamine neurotransmitters; coularray detector

單胺類物質(zhì)包括去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5HT)、五羥吲哚乙酸(5HIAA)等物質(zhì)，是哺乳動物和人類中樞神經(jīng)重要的信息傳遞物質(zhì)。研究該類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的含量變化，對于闡明藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制，提供了有力的依據(jù)。尤其在老年癡呆癥、抑郁癥、兒童多動癥、兒童多動穢語綜合征等疾病與神經(jīng)遞質(zhì)含量關(guān)系、藥物治療效果等方面的研究中，可提供非常有用的信息[1]。目前文獻(xiàn)報道此類物質(zhì)常見的檢測方法主要有高效液相色譜電化學(xué)檢測器測定法(HPLCECD)、熒光法、放射酶學(xué)分析法等[2]。其中以HPLCECD測定法報道的較多，但現(xiàn)有的HPLCECD測定法存在流動相成分復(fù)雜[3]、重現(xiàn)性差、檢測時間長、樣品前處理不徹底等問題。本研究改進(jìn)了現(xiàn)有的測定方法，建立起一種流動相單一、重現(xiàn)性好、檢測時間短、樣品處理完全，并可同時測定4種單胺類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

庫侖陣列電化學(xué)高效液相色譜儀[Model 5600A16通道檢測器(美國ESA公司)，Model 582 solvent Delivery System，Model 542 自動進(jìn)樣器，CoularrayWin工作站]，Dionex Tcc100型柱溫箱(美國戴安公司);Thermo D37520型高速冷凍離心機(jī)(德國Heraeus公司);pHS25型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);GenPure超純水系統(tǒng)(德國TKA公司);KQ500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率40 kHz);3 K超濾管(PALL公司);BP211D電子天平 (德國Sartorious);佳美SK1快速混勻器(江蘇金壇市佳美儀器廠);玻璃勻漿器。

1.2 試藥

去甲腎上腺素(NE，批號100169199402)、多巴胺(DA，批號100070200405)、5羥色胺(5HT，批號111656200401)、5羥基吲哚乙酸(5HIAA，批號140737200501) 均購自中國藥品生物制品檢定所;水為超純水，乙腈為色譜純(德國默克公司)，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20) g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(粵)20080020]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Luna C18柱(Phenomenex，150 mm×4.60 mm，5 μm)，Alltima C18預(yù)柱(Alltech，7.5 mm×4.6 mm，5 μm);流動相：緩沖液[每1 L超純水中含乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)37.2 mg、NaH2PO4 31.2 g、辛烷磺酸鈉1 g，pH值4.0]∶乙腈=87∶13，流速：1 mL·min-1;柱溫箱：35 ℃;自動進(jìn)樣器溫度：4 ℃;檢測電壓：350 mV;進(jìn)樣量：15 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 蛋白沉淀工作液的制備 取HCLO4 4.29 mL，加水稀釋至500 mL，得到0.1 mol·L-1 HCLO4溶液，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.2.2 混合對照品貯備液的制備 精密稱取NE、DA、5HT、5HIAA對照品各1 000 μg，用0.1 mol·L-1 HCLO4定容至2 mL容量瓶中，使其質(zhì)量濃度均為500 μg·mL-1。取以上4種對照品溶液各500 μL混勻，配制成各對照品質(zhì)量濃度均為125 μg·mL-1的混合對照品貯備液。

2.2.3 緩沖液的制備 取EDTA 37.2 mg(0.1 mmol·L-1)、NaH2PO431.2 g(0.2 mol·L-1)、辛烷磺酸鈉1 g溶解于1 L 超純水中，H3PO4調(diào)pH值至4.0。

2.2.4 供試品溶液的制備 取大鼠禁食12 h后，斷頭處死，在冰臺上迅速分離出大腦組織。將標(biāo)本稱質(zhì)量后，錫紙包好，腦組織作為實驗樣品保存于-80 ℃冰箱中。稱取腦組織0.2 g，加入0.1 mol·L-1 HCLO4溶液1 mL，冰浴勻漿。勻漿液渦旋混勻后置4 ℃高速冷凍離心機(jī)中12 000 r·min-1離心10 min，取上清液置3 K超濾管中進(jìn)行二次離心，超濾后清液作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

精密吸取蛋白沉淀工作液、混合對照品貯備液、供試品溶液各15 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。腦組織樣品中的NE、DA、5HIAA和5HT得到了良好的分離，保留時間分別為2.91、4.36、5.02 和8.34 min，其他雜質(zhì)不干擾測定結(jié)果。

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對照品貯備液適量，置6個容量瓶中，分別加入0.1 mol·L-1 HCLO4稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，使所含各對照品的質(zhì)量濃度分別為0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μg·mL-1，分別精密吸取15 μL 進(jìn)樣。以各組分的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，各組分的峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。表1 4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗

分別配制低(0.02 μg·mL-1)、中(0.5 μg·mL-1)、高(2.5 μg·mL-1)3種不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分裝后貯存于-80 ℃冰箱內(nèi)。日內(nèi)連續(xù)測5次，計算日內(nèi)精密度;每份樣本每日測5次，連續(xù)測定5日，計算日間精密度，見表2。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，計算各組分峰面積積分值RSD值，分別為1.18%(NE)、3.55%(DA)、1.19%(5HIAA)、0.87%(5HT)，表明供試品溶液在4 ℃條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率實驗

取大鼠腦組織，經(jīng)預(yù)處理后測定峰面積。再取上述腦組織分別加入低(0.02 μg·mL-1)、中(0.5 μg·mL-1)、高(2.5 μg·mL-1)3種濃度的混合對照品溶液，按照“2.2.4”項下方法制備加樣回收供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表2。表2 回收率與日內(nèi)、 日間精密度

2.8 檢測限測定

取“2.4”項下配制的混合對照品溶液(0.004 μg· mL-1)不斷用0.1 mol·L-1 HCLO4稀釋，進(jìn)樣15 μL，依法測定。以信噪比S/N≥3∶1 時樣品進(jìn)樣量為該條件下的檢測限，測得各神經(jīng)遞質(zhì)的檢測限分別0.018 15(NE)、0.016 05(DA)、0.016 8(5HIAA)、0.015 15(5HT)ng。

3 討論

3.1 樣品處理方法的選擇 在實驗過程中發(fā)現(xiàn)只用HCLO4處理樣品后即進(jìn)樣測定，柱壓會逐漸上升，甚至造成在線過濾器及電極的堵塞。因此在處理腦組織樣品時，采用超濾管進(jìn)行二次離心除蛋白，在提高樣品的純度的同時，可減少其對色譜柱及儀器的損害。

3.2 電壓值的選擇 本研究考察了4種神經(jīng)遞質(zhì)在-100～600 mV電壓范圍內(nèi)進(jìn)行測定的效果。結(jié)果在350 mV電壓條件下峰高與電壓比均較大，且基線噪音較小，符合含量測定的要求，因此選用此電壓作為工作電壓。

3.3 色譜條件的選擇 經(jīng)前期摸索，發(fā)現(xiàn)柱溫、流動相pH值、有機(jī)相與水相的配比變化均會影響4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分離情況。柱溫升高，流動相黏度降低，各組分保留時間均縮短。流動相pH值對5HIAA和5HT的影響較大，而對其它2種神經(jīng)遞質(zhì)影響較小，pH值降低可使 5HIAA的保留時間延長，而5HT 的保留時間縮短，NE、DA保留時間變化不大，但各化合物變化幅度不同，因此應(yīng)將pH值調(diào)至固定值。有機(jī)相與水相的配比則影響各物質(zhì)的保留時間及分離度，加大乙腈的量可以明顯縮短分析時間，尤其對5HT影響較大。而因為較高的柱溫和較低的流動相pH值將對儀器及色譜柱造成影響，故在滿足分離的情況下，本實驗采用了35 ℃的柱溫、用H3PO4調(diào)節(jié)pH值至4.0的流動相，同時為了縮短檢測時間將乙腈的比例提高至13%。

本實驗建立的方法可以在10 min 內(nèi)完成生物樣品中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定，并可得到較準(zhǔn)確的測定結(jié)果。此方法與文獻(xiàn)報道的方法相比具有流動相單一、重現(xiàn)性好、檢測時間短、樣品處理完全等優(yōu)點，可用于臨床上疾病的診斷以及新藥開發(fā)過程中的藥效研究。