作者：郭衛平劉燕張洪新李文獻倪代會梁智會

【關鍵詞】 阿霉素 關鍵詞: 阿霉素;高溫，誘發;肝腫瘤;細胞系;抗藥性，多藥 摘 要:目的 探討比較43℃加熱前后人肝癌細胞-7721（以下簡稱7721細胞）和耐藥人肝癌細胞模型-7721/Adm（以下簡稱7721/Adm細胞）細胞內阿霉素（ADM）藥物濃度的變化. 方法 以體外培養的人肝癌細胞-7721和作者自行培養建立的人肝癌細胞模型-7721/Adm為研究對象，采用水浴加溫法、流式細胞熒光技術觀察阿霉素化療加熱前后7721和7721/Adm細胞胞內阿霉素（ADM）濃度的變化. 結果 加熱后7721細胞組提高30.8%，HCC-7721/Adm組提高51%. 結論 加熱可明顯提高這兩種細胞內的阿霉素濃度，從而提高這兩種細胞的化療敏感性，為臨床克服多藥耐藥問題提供了重要依據. Keywords:doxorubicin;hyperthermia，induced;liver neo-plasms;cell line;drug resistance，multiple Abstract:AIM To comparatively study the cytotoxic effects of chemotherapy and thermo-chemotherapy of ADM on hu-man hepatocellular carcinoma cell line（7721）and human multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line（7721/Adm）.METHODS By means of water bath and MTT as-say，the inhibition pattern of cell growth was observed.The effects of hyperthermia on intracellular concentration of ADM of7721and that of7721/Adm were detected by flow cytome┐try.RESULTS ①Sensitivity of7721/Adm to ADM was significantly lower than that of7721;②Hyperthermia re-markably increased the sensitivity of7721and7721/Adm to AMD;③Hyperthermia increased the intracellular concentra-tion of ADM in those two sorts of cells mentioned above，es-pecially in7721/Adm.CONCLUSION Hyperthermia can in-crease the sensitivity of7721and7721/Adm to ADM. 0 引言 熱療在腫瘤治療上的應用已有較長的歷史.研究表明，加熱可以顯著提高某些腫瘤細胞對化療藥物的敏感性 ［1-5］ ，但其機制不很清楚.近年來，腫瘤細胞的多藥耐藥性影響腫瘤化療效果問題日益引起臨床醫生重視，并進行了卓有成效的研究，在藥物和生物因子逆轉耐藥性等方面取得一定進展;目前對加熱降低耐藥腫瘤細胞的耐藥性以及加熱對細胞耐藥性改變的分子生物學機制方面的了解和研究卻不深入，有關研究報道也不多.為此，作者在自行培養的人肝癌細胞耐藥模型-7721/Adm基礎上［6］ ，研究了加熱對該細胞內阿霉素濃度的影響，報告如下. 1 材料和方法 1.1 細胞培養 7721細胞由本校實驗動物中心提供，按常規法培養于PRMI-1640全培養液中（100mL?L-1 小牛血清，青霉素10萬u?L-1 ，鏈霉素100mg?L-1 ），單層培養于37℃，CO2 恒溫孵育箱內，用接種傳代第3日的細胞做實驗;自行建立7721/Adm細胞［6］ ，按常規法培養于含阿霉素（0.5mg?L-1 ）的PRMI-1640全培養液中（100mL/L-1 小牛血清，青霉素10萬u?L-1 ，鏈霉素100mg?L-1 ），單層培養于37℃，CO2 恒溫孵育箱內，用接種傳代穩定的細胞做實驗. 1.2 細胞處理 ①采用水浴加溫法（數字式恒溫浴槽，溫波±0.1℃），將7721細胞、7721/Adm細胞培養瓶浸沒于水中，溫度設定為43℃;加熱時間設定為30，60min兩組，每組4瓶;②阿霉素（ADM）終濃度設1mg?L-1 一個濃度，用微量進樣器加藥，化療時間統一為60min;③熱與ADM的組合采用熱化同時（加熱同時ADM化療）一個方式;④細胞分組:陰性對照組、單純化療組、加熱化療組共三組，每組4瓶;⑤將實驗處理過的細胞消化成細胞懸液（5×105 個細胞/mL）;⑥以未處理的細胞為陰性對照，以不含細胞的PRMI-1640全培養液為空白對照. 1.3 MTT藥敏實驗 將實驗處理過的細胞消化成細胞懸液（5×105 個細胞/mL）接種到96孔板上，每組設三個板、三個復孔，每孔200μL（1×105 個細胞/mL），以未經處理的細胞為陰性對照，以不含細胞的1640全培養液為空白對照，常規法培養過夜后，去上清液，加入MTT50μL/孔，繼續培養4～6h，去上清液后加入二甲基亞砜（DMSO）100μL/孔，充分震蕩5min，上酶聯免疫檢測儀，測波長490nm每孔的光密度值（A值），計算細胞存活率:存活率=（實驗孔的平均A值/陰性對照孔的平均A值）×100% 1.4 流式細胞儀測定胞質藥物濃度 采用流式細胞技術檢測7721細胞、7721/Adm細胞內阿霉素濃度［5］ .取實驗處理過的細胞消化成細胞懸液（5×105 個細胞/mL）），冷PBS（4℃，0.01mol?L-1 pH7.4）洗滌2次，再重懸于冷PBS中，4℃下保存至上樣行流式細胞儀檢測（激發波長488nm，接收波長575nm）.統計學處理:用SPLM統計軟件進行方差分析. 2 結果 2.1 熱化療的細胞毒作用 7721細胞、7721/Adm經阿霉素單純化療、43℃加熱化療處理，其細胞存活率如Tab1，結果顯示:7721細胞、7721/Adm細胞經加熱處理對阿霉素敏感性明顯提高. 2.2 細胞內阿霉素藥物濃度變化 利用流式細胞儀檢測細胞內阿霉素熒光強度的改變.結果如Tab1所示:7721細胞、7721/Adm細胞加熱化療組細胞內阿霉素的熒光強度明顯高于7721細胞、7721/Adm細胞單純化療組，其中7721細胞組提高30.8%，HCC-7721/Adm組提高51%，說明7721/Adm細胞加熱化療后與7721/Adm細胞化療相比，細胞內阿霉素的蓄積明顯增加. 3 討論 3.1 耐藥逆轉的有關進展 腫瘤細胞在多次化療后產生耐藥是影響療效的一大難題.為克服耐藥問題，研究人員已在藥物逆轉、單克隆抗體導向逆轉、利用脂質體改變細胞膜通透性、利用細胞因子、核酶、反義核酸等逆轉腫瘤多藥耐藥等方面進行了研究［7-12］ .但由于受到藥物本身具有毒副作用、單克隆抗體異源蛋白的免疫反應及其對正常細胞膜表面分子功能的影響等限制，應用前景并不樂觀.