作者：鄭曉暉，趙欣，房敏峰，王世祥，衛引茂，鄭建斌

【摘要】 目的 探討復方丹參方中使藥冰片對君藥丹參在新西蘭大白兔體內藥代動力學過程的影響。方法 丹參組、丹參冰片配伍組水煎液灌胃給藥，液液萃取法提取血漿中的丹參素，以對羥基苯甲酸為內標，采用離子阱質譜多級反應模式(MRM)測定兔血漿和腦脊液中丹參素的質量濃度，DAS數據處理軟件計算藥動學參數。結果 丹參冰片配伍給藥可使丹參中丹參素的藥動學參數t1/2α、t1/2β、kα、AUC(0-∞)較單獨給藥時明顯增大，丹參素的腦血比提高。結論 復方丹參方中，使藥冰片可提高君藥丹參中丹參素的生物利用度，減慢代謝，促進血腦屏障對丹參素的通透性。該研究可為“君–使”對藥體內作用機制的研究提供思路。

【關鍵詞】 丹參；冰片；藥代動力學；“君使”對藥

方劑是中藥新藥研發的基礎，其配伍理論及體內作用機制的研究是方劑關鍵科學問題的基礎及要點，也是制約復方最佳化和中藥現代化的瓶頸。復方丹參方是活血化瘀、芳香開竅、理氣止痛的名方。其臨床療效[1]、體外藥效學實驗[2]、有效成分的含量測定[3]及藥代動力學的研究[47]已有文獻報道。王怡等對使藥冰片在方劑中的作用進行了初步研究[8]，這對復方丹參方體內作用機制的研究具有積極作用。本研究選擇復方丹參方中使藥冰片和君藥丹參為對象，采用高效液相色譜離子阱質譜法(HPLCMSMS)研究君藥丹參與使藥冰片配伍前后，丹參中有效成分丹參素在兔體內的藥代動力學變化，以探討君使對藥的配伍機制，進而為中藥引經理論的研究提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

丹參、冰片藥材(均購于陜西省藥材公司，并經陜西省藥品檢驗所鑒定)，丹參素鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110855200304)；內標對羥基苯甲酸(西安化學試劑廠)，甲醇為色譜純(美國Fisher公司)；實驗用水為超純蒸餾水(自制)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括在線脫氣機、二元梯度泵，7725i手動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)；Agilent 1100 SL型電噴霧離子阱質譜；Anke TGL16G型高速離心機；基因公司Maxima超純水機；SartoriusBP221s型電子天平(美國Sartorius公司)；BF2000氮氣吹干儀；SK1型快速混勻器。

1.3 動物

新西蘭大白兔36只，體重2.0-2.2kg，♀♂各半。由西安交通大學實驗動物中心提供，動物合格證號：陜醫動字第08018號。

1.4 藥材供試品溶液的制備

取丹參、冰片藥材，粉碎，干燥至恒重。稱取丹參150g ，以8倍量水浸泡30min，加熱回流提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，減壓抽濾，濃縮至75mL，于4℃冰箱內保存。同法制備丹參(150g)冰片(2.7g)合煎液。

1.5 實驗設計

取新西蘭大白兔18只，隨機分為3組，每組6只，♀♂各半。丹參組丹參灌胃給藥，劑量為10g/kg，配伍組丹參冰片合煎液灌胃給藥，丹參給藥劑量為10g/kg，冰片給藥劑量為0.18g/kg。對照組給予等劑量的丹參后立刻20g/L羧甲基纖維素灌胃。各組分別于給藥后10、20、30、45、60、75、90、120、180、300、480、720min耳緣靜脈取血1.0mL，測定血漿中丹參素的質量濃度。另取新西蘭大白兔18只，隨機分為3組，每組6只，♀♂各半。烏拉坦麻醉后，股動脈埋管以備取血；切開頸后部皮膚并分離肌肉以備從小腦延髓池抽取腦脊液，分組及給藥方法同上，于給藥后20、30、45、60、75min同時取血1.0mL和腦脊液0.3mL，測定血漿和腦脊液中丹參素的質量濃度，并計算腦血比。

1.6 分析方法

1.6.1 分析條件

色譜條件：色譜柱為Agilent TCC18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇0.2%(體積分數)的甲酸水溶液(10∶90，V∶V)；檢測波長為280nm；柱溫為25℃；流速為0.8mL/min(柱后分流比3∶1)。質譜條件：電噴霧離子源；正離子檢測；噴霧電壓3.5kV；干燥氣流速8.0L/min；干燥氣溫度350℃；霧化氣壓力40.0p.s.i；質量掃描范圍50amu-1000amu。

1.6.2 生物樣品供試品溶液的制備

取1.5項下待測生物樣品(血漿1.0mL，腦脊液0.3mL)，8000r/min離心10min，取0.25mL上清液，加25μL 0.0021mg/mL對羥基苯甲酸，50μL 10%(體積分數)高氯酸沉淀蛋白，8000r/min離心10min，取上清液，用0.5mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，氮氣吹干，殘渣用0.5mL流動相溶解，0.45μm微孔有機濾膜濾過，10μL進樣分析。

1.6.3 丹參素鈉標準曲線的制備

取1.5項下對照組血漿或腦脊液0.25mL，加入 0.46mg/mL丹參素鈉對照品溶液0.001、0.002、0.005、0.010、0.050、0.100、1.0mL，置于10mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得質量濃度為0.0115、0.0230、0.0575、0.1150、0.575、1.150、11.50μg/mL的系列對照品溶液。按照1.6.2項下樣品制備方法制備成對照品溶液，采用離子阱質譜的多級反應模式(MRM)進行分析，丹參素鈉選擇m/z 198.2為母離子，m/z 181.2為子離子，內標物對羥基苯甲酸選擇m/z 139.3為母離子，m/z 93.1為子離子，分別計算m/z 181.2和m/z 93.1提取離子流圖的峰面積。以兩者峰面積的比值對丹參素鈉的質量濃度進行線性回歸，得方程為：Y=1.45X+3.61，γ=0.9999 (n=6)。結果表明：丹參素鈉在0.0115-11.5μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

1.6.4 方法有效性驗證

制備質量濃度分別為0.0230、0.1150、1.150μg/mL的丹參素鈉血漿對照品溶液 (每種5份)，按1.6.1項下的分析條件進行測定，記錄峰面積，以丹參素鈉測得量與加入量之比計算相對回收率。精密度用日內和日間變異表示。以各濃度分別在同日測定5次的峰面積，計算日內變異。再按以上測定方法每日測定1次，連續5日重復測定，記錄峰面積，計算日間變異。

1.7 數據處理

用SPSS11.0進行數據處理，實驗結果以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，顯著性檢驗水平設為α=0.05。藥動學參數的計算用DAS 2.0 藥動學程序自動處理。

2 結果

2. 1 色譜行為及專屬性

在上述分析條件下，對照組、丹參組和丹參冰片配伍組血漿樣品供試品溶液色譜圖見圖1-圖3。由圖可見，丹參素及內標在擬定色譜條件下均無內源性或外源性干擾，且與其他成分基線分離良好。

2.2 方法有效性驗證

方法最低檢測限為0.96ng/mL(S/N=3)?；厥章屎腿諆取⑷臻g變異符合生物樣品分析指導原則[9]的要求，數據見表1。表1 方法有效性驗證實驗結果（略）

2.3 使藥冰片對丹參素藥代動力學的影響

所有數據均用DAS軟件進行處理。圖4為丹參組與配伍組丹參素的平均藥時曲線圖。與丹參組相比，配伍組的曲線下面積明顯增大。主要藥代動力學參數見表2。與丹參組相比，配伍組藥代動力學參數t1/2α， t1/2β， kα，AUC(0-∞)均有明顯增大，經t檢驗分析，提示冰片與丹參配伍可影響丹參的吸收和代謝。配伍組t1/2Ka降低，提示冰片可加快丹參素在體內的吸收速率；分布容積V/F增加約2倍，提示冰片明顯增加丹參素在體內與血漿蛋白等大分子的結合率。丹參素的腦血比測定結果見表3。經重復測量的方差分析表明，與丹參組相比，配伍組丹參素的腦血比在20、30、45、60、75min均顯著性升高(P<0.05)；丹參組、配伍組組內各采樣時間丹參素腦血比均無顯著性差異，提示冰片提高血腦屏障對丹參素的通透性，增加丹參素在腦脊液中的分布。表2 丹參組與丹參冰片配伍組丹參素兔體內藥代動力學參數（略）表3 冰片對丹參素腦血比影響測定結果（略）

3 討 論

以往報道，冰片可促進胃腸道對其他藥物的吸收[8]。但在本研究中，冰片與丹參配伍給藥時，丹參素血漿藥物濃度上升較慢，t1/2α增大，提示冰片在胃腸道內可能干擾了丹參素的吸收速率；兩組平均藥時曲線交點以后，配伍組的血漿藥物濃度始終高于丹參組(圖4)，AUC(0-∞)明顯增加，說明冰片能提高其生物利用度。君藥是復方的核心，在方劑中起決定性作用。使藥的作用有兩個方面，其一為引經，引導藥力直達病所；其二為協調諸藥，使復方藥力成為一個有機整體。本研究選擇復方丹參方中君藥丹參和使藥冰片為研究對象，以丹參的主要藥效成分為指標，而將使藥冰片作為一個整體，研究使藥對君藥藥代動力學及組織分布的影響，旨在發現使藥引藥直達病所的體內機制，為中藥引經理論及配伍理論的研究提供思路和方法。