作者：付昌文，呂天潤，曹小建，劉 軍

【摘要】 目的 使用99mTc示蹤初步研究注射用NGF在家兔體內藥代動力學。方法 將NGF用99mTc標記，利用同位素示蹤法和TCA沉淀法測得NGF含量與放射性計數的線性關系，并由靜脈注射至家兔體內，通過上述檢測方法得到不同時段血漿中微量NGF濃度，使用3P87軟件分析藥代動力學參數并初步分析組織分布。結果 NGF靜脈注射后的家兔體內代謝符合二隔室分布模型；按劑量40μg/kg靜注后，測得T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－１。結論 99mTc具有較好的示蹤效果，適用于體內藥代動力學研究。 【關鍵詞】 99mTc-NGF；藥代動力學；TCA沉淀法 【Abstract】 Objective To study the pharmacokinetics of NGF in rabbit by isotopic tracing. Methods NGF was labeled with99mTc，and its γ-ray counts was detected by isotopic tracing and trichloroacetic acid ( TCA) precipitation method. From cpm of γ-ray and NGF content of samples， the standard curve was drawn and it was nearly a line.99mTc-NGF was injected into rabbit(n=30) body from vena auris . Samples of rabbit blood were collected in different time (0.00833， 0.0166， 0.05， 0.0833， 0.166， 0.25， 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5， 4h). The techniques above were used to detect NGF concentration in rabbit blood and data were inputted into computer to analysis the pharmacokinetic parameter by software (3P87). Results The metabolism in vivo conforms the double-compartments model. With the dose of 40μg/kg， the pharmacokinetics parameters were as the follows： T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－１。 Conclusion The mark of 99mTC has better effect on pharmacokinetic research of nerve growth factor. 【Key words】 99mTc-NGF； pharmacokinetics； TCA 神經生長因子（NGF）是神經營養因子家族中最重要的生物活性物質，其對神經元的生長、發育、分化、再生和功能表達具有重要的調控作用。現階段其在應用上已經公認對腦和脊髓損傷、早老性癡呆［1～3］、糖尿病周圍神經性疾病［4］等有很好效果。發現者Stanley Cohen和Rita Levi-Montalcini于1986年獲得諾貝爾醫學獎［5］。有關NGF的血藥濃度檢測已有很多報道，但都比較復雜。本文將NGF用99mTc標記，利用同位素示蹤法和TCA沉淀法測得NGF含量，從而初步研究NGF脂質體在家兔體內藥代動力學，以期為其他相關試驗及今后的臨床應用提供必要的參考資料。 1 材料與方法 1.1 儀器與試劑 1.1.1 儀器 GC-911γ射線計數儀（中國科技大學儀器廠）； Ultrospec2000紫外分光光度儀(Pharmacia公司)； DFM-96多排放射免疫計數儀（眾成電機技術公司）； FJ-391A1型活度儀（北京放射性儀表廠）； 3P97軟件(江蘇省人民醫院藥劑科合作提供)； FA1004電子天平（上海精科天平）。 1.1.2 試劑 小鼠頜下腺2.5S NGF（南京軍事醫學研究所提純，純度>98%，文章另發）；99mTcO4(北京原子高科核技術應用股份有限公司)； 亞錫（上海化學試劑三廠）； Kieselgel 60 F254 硅膠板（德國EM science）； 檸檬酸緩沖液（南京森科醫藥公司）； 三氯乙酸（南京生興生物技術公司分裝）； Sephadex G-25(南京森科醫藥公司提供)。 1.3 實驗動物 實驗用新西蘭兔(雌雄各半、2.5kg，南京愛立默動物實驗有限公司)。 1.4 方法 1.4.1 同位素示蹤法與TCA沉淀法檢測血漿中微量NGF 用放射性元素99mTc標記NGF，對99mTc-NGF用TCA沉淀［6］，然后對沉淀物進行γ計數儀計數，數值與NGF的含量存在線性關系，從而測定在血漿中微量NGF的濃度。 1.4.1.1 標準曲線的制備 99mTc－NGF的制備：配制0.5％亞錫（Sn2＋）－檸檬酸緩沖液（cit）。取NGF20ml（含20mg NGF）、cit溶液100ml及配制的0.5％Sn2＋-cit溶液20ml，將其置于小瓶中，充入氮氣3～5min，即制備完藥箱置于4℃冰箱待標記時取出。加10mgVitC于cit溶液中，制備成10mg/mlVitC溶液；取出制備的藥箱，在其小瓶中加0.3ml 高锝酸（99mTcO4）(具體放射量根據需要)，然后加入配制的10mg/mlVitC溶液0.1ml，混勻。即制備完99mTc－NGF。 樣品經Sephadex G-25凝膠柱分離純化，收集各組分，測量每管的γ計數，合并各峰收集組分并取出60μl，加考馬斯亮藍R-250染色，用紫外分光光度儀測定595nm處的吸光度，計算NGF的化學量。以收集99mTc-NGF峰的總放射性除以上樣層析時的總放射性，即得99mTc-NGF的標記率。99mTc-NGF峰的總放射性除以該峰的總蛋白質量，即得比活度。紙層析法測定99mTc-NGF的放化純度。 配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于試管中，加150μl生理鹽水及30μl兔血清，加20％三氯乙酸200μl，5000rpm離心3min。去上清，測定各試管中沉淀物放射性計數，繪制標準曲線，求回歸方程及回歸系數。 1.4.1.2 測定方法的確證 通過檢測回收率及重復性試驗研究證明該方法的可行性。(1)回收率的測定：配置99mTc-NGF濃度為250、500、750ng/ml各5份，然后按照上述方法（標本處置同標準）測定實測99mTc-NGF的濃度；共進行5次計算該方法及線性關系回收率。每次測定前同時測定標準品沉淀物的放射性計數并繪制標準曲線以去除核素衰變影響。(2)精確度的測定：配制成濃度為250、500、750ng/ml的99Tc-NGF樣品各5份，按照上述方法（標本處置同標準）測定NGF濃度，每個濃度一天內重復測定5次，計算日內相對標準偏差；每天測定1次，連續5天測定，計算日間相對標準偏差，測定當日重新標記和配制標準液。

注：n＝5 結果顯示：當給藥劑量為40μg/kg時，NGF藥動學參數為T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－１。 3 討論 檢測血液中NGF濃度常用方法有ELISA、HPLC等，這些方法靈敏度和精確度均較高，相關文獻很多，但是操作繁瑣，費用較高，影響結果因素較多。本實驗在選擇同位素示蹤法來檢測NGF血藥濃度，此方法通過放射性原理避免了對NGF的檢測方面的影響。 同位素示蹤常用核素有125I、99mTc等，125I半衰期長較為穩定，但標記率很低，且對環境和同位素防護及處理要求非常高，因此在使用時收到很多限制；99mTc標記率高［7］，同位素處理簡單，對人員身體影響小，但半衰期短，對檢測時間要求相對較高。本實驗中筆者通過99mTc標記NGF，使用TCA沉淀法及同位素示蹤法進行血液中微量NGF濃度檢測，通過藥代動力學相關參數分析，證明靜脈注射NGF在小鼠體內的藥代動力學符合雙隔室模型，是一種很好的藥物代謝研究方法。

1 Boado RJ， Tsukamoto H， Pardridge WM.Drugs delivery of antisense molecules to the brain for treatment of Alzheimer’s disease and cerebral AIDS.Journal of Pharmaceutical Sciences， 1998，87(11)：1308-1315. 2 Tamai I，Tsuji T. Transpoter-mediated permeation of drugs across the blood-brain barrier. J Pharma Sci， 2000， 89（11）：1371-1888. 3 Gustilo MC， Alicja L， Markowska AL，et al. Evidence that nerve growth factor influences recent memory through structural changes in septohippocampal cholinergic neurons. J Comp Neurol， 1999，405：491-507. 4 柳川. 糖尿病周圍神經病與神經生長因子.國外醫學·藥學分冊，1998，（788）：87-94. 5 丁玄宙.1986年諾貝爾生理學或醫學獎：神經生長因子和表皮生長因子的發現.生理科學進展，1987，18 (2)：191. 6 姜國輝，唐剛華，張云. 神經生長因子的藥代動力學研究. 中國藥學雜志，2000，35(3)：181-184. 7 李永健，孫其薰. 放射性藥物與標記化合物. 北京：科學出版社， 1996，40-45.