作者：付昌文，呂天潤，曹小建，劉 軍

【摘要】 目的 使用99mTc示蹤初步研究注射用NGF在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。方法 將NGF用99mTc標(biāo)記，利用同位素示蹤法和TCA沉淀法測得NGF含量與放射性計(jì)數(shù)的線性關(guān)系，并由靜脈注射至家兔體內(nèi)，通過上述檢測方法得到不同時(shí)段血漿中微量NGF濃度，使用3P87軟件分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并初步分析組織分布。結(jié)果 NGF靜脈注射后的家兔體內(nèi)代謝符合二隔室分布模型；按劑量40μg/kg靜注后，測得T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－１。結(jié)論 99mTc具有較好的示蹤效果，適用于體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。 【關(guān)鍵詞】 99mTc-NGF；藥代動(dòng)力學(xué)；TCA沉淀法 【Abstract】 Objective To study the pharmacokinetics of NGF in rabbit by isotopic tracing. Methods NGF was labeled with99mTc，and its γ-ray counts was detected by isotopic tracing and trichloroacetic acid ( TCA) precipitation method. From cpm of γ-ray and NGF content of samples， the standard curve was drawn and it was nearly a line.99mTc-NGF was injected into rabbit(n=30) body from vena auris . Samples of rabbit blood were collected in different time (0.00833， 0.0166， 0.05， 0.0833， 0.166， 0.25， 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5， 4h). The techniques above were used to detect NGF concentration in rabbit blood and data were inputted into computer to analysis the pharmacokinetic parameter by software (3P87). Results The metabolism in vivo conforms the double-compartments model. With the dose of 40μg/kg， the pharmacokinetics parameters were as the follows： T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－１。 Conclusion The mark of 99mTC has better effect on pharmacokinetic research of nerve growth factor. 【Key words】 99mTc-NGF； pharmacokinetics； TCA 神經(jīng)生長因子（NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最重要的生物活性物質(zhì)，其對(duì)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、再生和功能表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。現(xiàn)階段其在應(yīng)用上已經(jīng)公認(rèn)對(duì)腦和脊髓損傷、早老性癡呆［1～3］、糖尿病周圍神經(jīng)性疾病［4］等有很好效果。發(fā)現(xiàn)者Stanley Cohen和Rita Levi-Montalcini于1986年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)［5］。有關(guān)NGF的血藥濃度檢測已有很多報(bào)道，但都比較復(fù)雜。本文將NGF用99mTc標(biāo)記，利用同位素示蹤法和TCA沉淀法測得NGF含量，從而初步研究NGF脂質(zhì)體在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)，以期為其他相關(guān)試驗(yàn)及今后的臨床應(yīng)用提供必要的參考資料。 1 材料與方法 1.1 儀器與試劑 1.1.1 儀器 GC-911γ射線計(jì)數(shù)儀（中國科技大學(xué)儀器廠）； Ultrospec2000紫外分光光度儀(Pharmacia公司)； DFM-96多排放射免疫計(jì)數(shù)儀（眾成電機(jī)技術(shù)公司）； FJ-391A1型活度儀（北京放射性儀表廠）； 3P97軟件(江蘇省人民醫(yī)院藥劑科合作提供)； FA1004電子天平（上海精科天平）。 1.1.2 試劑 小鼠頜下腺2.5S NGF（南京軍事醫(yī)學(xué)研究所提純，純度>98%，文章另發(fā)）；99mTcO4(北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司)； 亞錫（上海化學(xué)試劑三廠）； Kieselgel 60 F254 硅膠板（德國EM science）； 檸檬酸緩沖液（南京森科醫(yī)藥公司）； 三氯乙酸（南京生興生物技術(shù)公司分裝）； Sephadex G-25(南京森科醫(yī)藥公司提供)。 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔(雌雄各半、2.5kg，南京愛立默動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司)。 1.4 方法 1.4.1 同位素示蹤法與TCA沉淀法檢測血漿中微量NGF 用放射性元素99mTc標(biāo)記NGF，對(duì)99mTc-NGF用TCA沉淀［6］，然后對(duì)沉淀物進(jìn)行γ計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，數(shù)值與NGF的含量存在線性關(guān)系，從而測定在血漿中微量NGF的濃度。 1.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 99mTc－NGF的制備：配制0.5％亞錫（Sn2＋）－檸檬酸緩沖液（cit）。取NGF20ml（含20mg NGF）、cit溶液100ml及配制的0.5％Sn2＋-cit溶液20ml，將其置于小瓶中，充入氮?dú)?～5min，即制備完藥箱置于4℃冰箱待標(biāo)記時(shí)取出。加10mgVitC于cit溶液中，制備成10mg/mlVitC溶液；取出制備的藥箱，在其小瓶中加0.3ml 高锝酸（99mTcO4）(具體放射量根據(jù)需要)，然后加入配制的10mg/mlVitC溶液0.1ml，混勻。即制備完99mTc－NGF。 樣品經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱分離純化，收集各組分，測量每管的γ計(jì)數(shù)，合并各峰收集組分并取出60μl，加考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用紫外分光光度儀測定595nm處的吸光度，計(jì)算NGF的化學(xué)量。以收集99mTc-NGF峰的總放射性除以上樣層析時(shí)的總放射性，即得99mTc-NGF的標(biāo)記率。99mTc-NGF峰的總放射性除以該峰的總蛋白質(zhì)量，即得比活度。紙層析法測定99mTc-NGF的放化純度。 配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于試管中，加150μl生理鹽水及30μl兔血清，加20％三氯乙酸200μl，5000rpm離心3min。去上清，測定各試管中沉淀物放射性計(jì)數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程及回歸系數(shù)。 1.4.1.2 測定方法的確證 通過檢測回收率及重復(fù)性試驗(yàn)研究證明該方法的可行性。(1)回收率的測定：配置99mTc-NGF濃度為250、500、750ng/ml各5份，然后按照上述方法（標(biāo)本處置同標(biāo)準(zhǔn)）測定實(shí)測99mTc-NGF的濃度；共進(jìn)行5次計(jì)算該方法及線性關(guān)系回收率。每次測定前同時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)品沉淀物的放射性計(jì)數(shù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以去除核素衰變影響。(2)精確度的測定：配制成濃度為250、500、750ng/ml的99Tc-NGF樣品各5份，按照上述方法（標(biāo)本處置同標(biāo)準(zhǔn)）測定NGF濃度，每個(gè)濃度一天內(nèi)重復(fù)測定5次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；每天測定1次，連續(xù)5天測定，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測定當(dāng)日重新標(biāo)記和配制標(biāo)準(zhǔn)液。

注：n＝5 結(jié)果顯示：當(dāng)給藥劑量為40μg/kg時(shí)，NGF藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－１。 3 討論 檢測血液中NGF濃度常用方法有ELISA、HPLC等，這些方法靈敏度和精確度均較高，相關(guān)文獻(xiàn)很多，但是操作繁瑣，費(fèi)用較高，影響結(jié)果因素較多。本實(shí)驗(yàn)在選擇同位素示蹤法來檢測NGF血藥濃度，此方法通過放射性原理避免了對(duì)NGF的檢測方面的影響。 同位素示蹤常用核素有125I、99mTc等，125I半衰期長較為穩(wěn)定，但標(biāo)記率很低，且對(duì)環(huán)境和同位素防護(hù)及處理要求非常高，因此在使用時(shí)收到很多限制；99mTc標(biāo)記率高［7］，同位素處理簡單，對(duì)人員身體影響小，但半衰期短，對(duì)檢測時(shí)間要求相對(duì)較高。本實(shí)驗(yàn)中筆者通過99mTc標(biāo)記NGF，使用TCA沉淀法及同位素示蹤法進(jìn)行血液中微量NGF濃度檢測，通過藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)分析，證明靜脈注射NGF在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)符合雙隔室模型，是一種很好的藥物代謝研究方法。

1 Boado RJ， Tsukamoto H， Pardridge WM.Drugs delivery of antisense molecules to the brain for treatment of Alzheimer’s disease and cerebral AIDS.Journal of Pharmaceutical Sciences， 1998，87(11)：1308-1315. 2 Tamai I，Tsuji T. Transpoter-mediated permeation of drugs across the blood-brain barrier. J Pharma Sci， 2000， 89（11）：1371-1888. 3 Gustilo MC， Alicja L， Markowska AL，et al. Evidence that nerve growth factor influences recent memory through structural changes in septohippocampal cholinergic neurons. J Comp Neurol， 1999，405：491-507. 4 柳川. 糖尿病周圍神經(jīng)病與神經(jīng)生長因子.國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊，1998，（788）：87-94. 5 丁玄宙.1986年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)：神經(jīng)生長因子和表皮生長因子的發(fā)現(xiàn).生理科學(xué)進(jìn)展，1987，18 (2)：191. 6 姜國輝，唐剛?cè)A，張?jiān)? 神經(jīng)生長因子的藥代動(dòng)力學(xué)研究. 中國藥學(xué)雜志，2000，35(3)：181-184. 7 李永健，孫其薰. 放射性藥物與標(biāo)記化合物. 北京：科學(xué)出版社， 1996，40-45.